التشريح المجهري وتلطيخ التألق المناعي لأكمام عضلة القلب في الأوردة الرئوية للفئران

Summary

يوضح هذا البروتوكول العزل الموجه بالفحص المجهري وتلطيخ الأوردة الرئوية للفئران. نقوم بإعداد عينات الأنسجة التي تحتوي على الأذين الأيسر والأوردة الرئوية والرئتين المقابلة وتلطيخها لقلب Troponin T و Connexin 43.

Abstract

الأوردة الرئوية (PVs) هي المصدر الرئيسي للضربات خارج الرحم في عدم انتظام ضربات القلب الأذيني وتلعب دورا حاسما في تطور وتطور الرجفان الأذيني (AF). تحتوي PVs على أكمام عضلة القلب (MS) المكونة من خلايا عضلة القلب. يتورط مرض التصلب العصبي المتعدد في بدء وصيانة الرجفان الأذيني ، حيث يحافظ على أوجه التشابه مع عضلة القلب العاملة في القلب ، بما في ذلك القدرة على توليد نبضات كهربائية خارج الرحم. تستخدم القوارض على نطاق واسع وقد تمثل نماذج حيوانية ممتازة لدراسة عضلة القلب الوريدية الرئوية لأن خلايا عضلة القلب موجودة على نطاق واسع في جميع أنحاء جدار الوعاء الدموي. ومع ذلك ، فإن التشريح الدقيق وإعداد PVs الفئران يمثل تحديا بسبب صغر حجم العضو والتشريح المعقد.

نعرض بروتوكول تشريح مجهري موجه بالمجهر لعزل الأذين الأيسر للفأر (LA) مع PVs. يتم إجراء تلطيخ التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة Troponin-T القلبية (cTNT) و connexin 43 (Cx43) لتصور LA و PVs بالطول الكامل. يوفر التصوير عند التكبير 10x و 40x رؤية شاملة للهيكل الكهروضوئي بالإضافة إلى رؤى مفصلة حول بنية عضلة القلب ، ولا سيما تسليط الضوء على وجود connexin 43 داخل MS.

Introduction

الرجفان الأذيني (AF) هو عدم انتظام ضربات القلب المستمر الأكثر شيوعا¹. يتزايد انتشار الرجفان الأذيني بشكل أكبر مع عدد متوقع من ~ 17.9 مليون مريض في أوروبا في عام 2060¹. الرجفان الأذيني مهم للغاية سريريا لأنه عامل خطر أساسي لتطور احتشاء عضلة القلب أو قصور القلب أو السكتة الدماغية ، مما يؤدي إلى عبء فردي واجتماعي واجتماعي واقتصادي هائل¹. على الرغم من أن الرجفان الأذيني معروف منذ عقود ، إلا أن الفيزيولوجيا المرضية للرجفان الأذيني لا تزال غير مفهومة تماما².

بالفعل في أواخر تسعينيات القرن العشرين ، أظهرت الدراسات التأثير الكبير للأوردة الرئوية (PVs) في بدء والحفاظ على AF ، لأنها المصدر الرئيسي للضربات خارج الرحم التي تحفز^{AF 3}. وقد ثبت أن PVs تختلف هيكليا عن الأوعية الدموية الأخرى. بينما تحتوي الأوعية الدموية النموذجية على خلايا عضلية ملساء ، فإن وسائط الغلالة في PVs تحتوي أيضا على خلايا عضلية قلبية⁴. في القوارض ، توجد هذه العضلات القلبية في كل مكان في جميع أنحاء الخلايا الكهروضوئية بأكملها ، بما في ذلك الأجزاء داخل الرئة وخارجها ، وكذلك منطقة الفتحة⁵. في البشر ، تحتوي PVs أيضا على خلايا عضلية قلبية ، والتي يمكن ملاحظتها ضمن امتدادات الأذين الأيسر (LA) عضلة القلب ما يسمى بأكمام عضلة القلب (MS)^6,7.

مرض التصلب العصبي المتعدد له أوجه تشابه مورفولوجية مع عضلة القلب^{الأذينية 8}. لا يختلف شكل وحجم الخلايا العضلية القلبية الأذينية والكهروضوئية اختلافا كبيرا بين بعضها البعض وتظهر خصائص فسيولوجية كهربية قابلة للمقارنة⁸. أثبتت التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية داخل الكهروضوئية النشاط الكهربائي لمرض التصلب العصبي المتعدد ، وكشف التصوير الوعائي عن تقلصات متزامنة مع نبضات القلب ^9,10.

تقاطعات الفجوة عبارة عن مجمعات بروتينية مكونة للمسام تتكون من ست وحدات فرعية connexin ، والتي تسمح بمرور الأيونات والجزيئات الصغيرة¹¹. توجد تقاطعات الفجوة في المواضع من خلية إلى خلية ، وتربط الخلايا العضلية القلبية المجاورة ، وتمكن من اقتران كهربائي بين الخلايا بين الخلايا العضلية^{القلبية 12,13}. يتم التعبير عن العديد من أشكال connexin isoforms في القلب مع connexin 43 (Cx43) كونه الشكل المتماثل الأكثر شيوعا الذي يتم التعبير عنه في جميع مناطق القلب¹⁴. تقدم الدراسات السابقة دليلا على التعبير عن Cx43 في خلايا عضلة القلب في PVs^15,16.

لا يزال من الصعب التحقيق في مرض التصلب العصبي المتعدد داخل الخلايا الكهروضوئية السليمة بسبب بنيتها الدقيقة ، خاصة في النماذج الحيوانية الصغيرة. هنا ، نوضح كيفية تحديد وعزل PVs مع LA وفصوص الرئة في الفئران باستخدام التشريح المجهري الموجه بالمجهر. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر تلطيخ التألق المناعي (IF) للخلايا الكهروضوئية لتصور خلايا عضلة القلب وترابطها داخل الخلايا الكهروضوئية.

Protocol

تم إجراء رعاية وجميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية والأخلاقيات بجامعة لودفيغ ماكسيميليان في ميونيخ ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات باستخدام الفئران من قبل Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178 ، ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). تم الحصول على الفئران C57BL6 / N تجاريا.

1. التحضير

1. تحضير هلام الأغاروز 3 ٪ عن طريق خلط 3 ملغ من الأغاروز و 100 مل من 1x محلول ملحي مخزن تريس في قارورة Erlenmeyer 500 مل. سخني المحلول في الميكروويف على حرارة 600 واط لمدة 2-3 دقائق حتى يصبح الجل متجانسا.
2. تحضير طبق التشريح عن طريق صب الجل بلطف في طبق بتري قطره 100 مم. ملء نصف طبق بتري مع هلام. مسح فقاعات من الجل لضمان اتساق متجانس. اترك طبق التشريح ليبرد حتى يصبح الجل صلبا.
3. قم بإعداد جميع المخازن المؤقتة والحلول اللازمة ، بما في ذلك محلول التثبيت ، ومحلول النفاذية ، وحاجز الحجب ، ومخزن الغسيل وفقا للوصفات الواردة في الجدول 1.

2. حصاد الأعضاء وإعداد الأنسجة

ملاحظة: تم نشر بروتوكول شامل يوضح بالتفصيل إجراء تخدير الفئران وحصاد القلب^{سابقا 17،18}. وبالتالي ، فإننا نقدم فقط وصفا موجزا لهذا الجزء. أجريت التجارب على الفئران C57BL6 البالغة من العمر 12 إلى 16 أسبوعا (ستة ذكور وأربع إناث). امتد وزن جسم الذكر من 26 جم إلى 28 جم ووزن جسم الأنثى من 19 جم إلى 22 جم. تم تنفيذ الخطوات التالية دون حقن الهيبارين الجهازي المسبق.

1. تخدير الماوس باستخدام الأيزوفلوران (5٪ ، 95٪ أكسجين ، التدفق: 1 لتر / دقيقة) وضمان عمق التخدير الكافي.
2. انقل الماوس إلى مكتب العمليات وضعه في وضع ضعيف. الحفاظ على التخدير مع استنشاق الأيزوفلوران (2٪ ، 98٪ أكسجين ، التدفق: 1 لتر / دقيقة) من خلال قناع التخدير وتثبيت الماوس بشريط لاصق في أطرافه. حقن الفنتانيل للتسكين (0.1 ملغ / 25 غرام من وزن الجسم أي ب.).
3. ارفع الفراء في عملية الخنجري واضبط قطعا مستعرضا 2 مم. افصل الفراء عن اللفافة تحت الجلد باستخدام تشريح حاد (مؤخر المقص) وقم بتمديد القطع بشكل قحفي وجانبي لفضح الصدر.
4. افتح بعناية الذيلية البطن إلى القوس الساحلي. ارفع العملية الخنجرية قليلا لشق الحجاب الحاجز من الذيلية وجعل الرئتين تنهار. ثم ، قم بقطع الحجاب الحاجز من اليسار إلى اليمين دون إصابة أي أعضاء وافتح الصدر بشكل ثنائي لكشف القلب.
5. قطع الوريد الأجوف السفلي (IVC) بينما لا يزال القلب ينبض لإخراج الفأر والمضي قدما في تخلل القلب عن طريق اختراق البطين الأيسر بإبرة 27 G وحقن 10 مل من محلول ملحي متجمد بالفوسفات (PBS).
6. بعد إزالة الدم من قلب الفأر ، حدد موقع قوس الأبهر والوريد الأجوف العلوي (SVC) والقصبة الهوائية. قطعها ~ 3 مم فوق قاعدة القلب وحصاد القلب مع الرئتين المتصلتين.
7. اغمر الأعضاء المحصودة في أنبوب مخروطي سعة 10 مل يحتوي على 2 مل من محلول السكروز المعقم بنسبة 30٪. اترك العينات تجف لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية.

3. التحضير الموجه بالمجهر ل LA و PVs

1. ضع القلب والرئتين المجففين في طبق تشريح يحتوي على 40-50 مل من 1x PBS. ضعه تحت مجهر المجال الساطع مع تكبير 10x وقم بإعداد الإضاءة. ضع القلب بسطحه الظهري على طبق التشريح. حدد الانتقال بين جدار البطين وجدار الأذينين، وافصل البطينين بعناية عن الأذينين باستخدام مقص جراحي.
   ملاحظة: قطع حوالي 1 مم أسفل الأذينين للحفاظ على بعض أنسجة البطين. ستكون هناك حاجة إلى هذا لاحقا لتثبيت الأذينين في طبق التشريح دون الإضرار بالهياكل في قاعدة القلب. نقترح الاحتفاظ بالبطينين حيث يمكن استخدامهما كعينة تحكم إيجابية. لتضمين أنسجة البطين ، اتبع نفس الإجراء الموضح لتضمين PVs ، كما هو موضح في القسم 4.
2. ضع الأذينين المنفصلين مع سطح القطع البطيني (الخطوة 3.1) على طبق التشريح بحيث تكون قاعدة القلب متجهة لأعلى. قم بتوجيه الأذينين بحيث يكون فصوص الرئة خلفية، ويكون LA والزائدة الأذينية اليسرى (LAA) على اليمين، والأذين الأيمن (RA) والزائدة الأذينية اليمنى (RAA) على اليسار. إصلاح التحضير عن طريق تثبيت أنسجة البطين الأيسر المتبقية على طبق التشريح. انشر فصوص الرئة برفق دون استخدام القوة المفرطة وقم بتثبيتها في طبق التشريح (الشكل 1 أ).
3. احصل على نظرة عامة على المعالم التشريحية في قاعدة القلب.
   1. ابحث عن الشريان الأورطي مع وجود قوس الأبهر في وسط قاعدة القلب.
   2. الكشف عن الجذع الرئوي (PT) مباشرة إلى يمين الشريان الأورطي واتبع مساره نحو المؤخرة لتمييز الشرايين الرئوية (PAs). تحقق من موقعها باتباع مسارها حتى الفص الأيسر والفص العلوي / الأوسط الأيمن للعثور على هيلوم الرئة المقابل (LH).
   3. تحديد موضع القصبة الهوائية و / أو القصبات الهوائية الرئيسية اليسرى واليمنى (L Br ، R Br) ، والتي تقع خلف الشريان الأورطي ، والتحقق من موقعها باتباع مسارها نحو LH (الشكل 1A).
   4. ابحث عن SVC على يسار الشريان الأورطي وتحقق باتباع مساره في RA بجوار RAA.
4. قم بإزالة الأنسجة الضامة والدهنية حول قاعدة القلب مع الحفاظ على جميع المعالم المحددة المذكورة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإزالة قوس الأبهر والقصبة الهوائية للحصول على رؤية مجانية لقاعدة القلب (الشكل 1 ب).
5. افصل المناطق المحمية برفق عن السطح العلوي للأذين عن طريق التشريح الحاد باستخدام ملقط دقيق. بعد ذلك ، قم بقطعها عند LH وقلبها إلى الجانب لكشف الجدار الخالي من الأذين الأيسر (LAFW) والخلايا الكهروضوئية في أبعادها الكاملة. قطع الشعب الهوائية الرئيسية من LH وإزالة الأنسجة الشعب الهوائية (الشكل 1C).
   ملاحظة: يعمل LH كنقطة دخول مشتركة للمناطق المحمية والممرات الهوائية إلى الرئتين ، وكذلك نقطة خروج PVs. من المهم إجراء كل إجراء في LH بعناية لتجنب أي ضرر للخلايا الكهروضوئية.
6. لفصل LA / RA والبطين الأيسر والأيمن (LV ، RV) ، قم بإجراء قطع بدءا من الجزء الأمامي من RV المتبقي لأعلى من خلال الصمام ثلاثي الشرف (TV) حتى الجانب الأمامي من SVC لفتح RA من الجانب الأمامي. قطع الجدار الخلفي الحر من التهاب المفاصل الروماتويدي (RAFW) بجوار الحاجز بين الأذينين لفصل RA و LA. قطع جدار البطين الأيمن الخلفي بجوار الحاجز بين البطينين لقطع LV و RV تماما.
   ملاحظة: تم نشر بروتوكول شامل يصف إجراء تحضير وعزل الأذين الأيمن بالتفصيل^{سابقا 19}. يعد فصل التهاب المفاصل الروماتويدي مفيدا لإزالة الأنسجة غير المرغوب فيها من مركب الأنسجة LA-PV وجمع الأنسجة لإجراء تجارب إضافية.
7. تقليل حجم فصوص الرئة عن طريق قطع بعض أنسجة الرئة القاعدية بحيث يتم ترك ما يقرب من 3-4 مم من أنسجة الرئة.
   ملاحظة: حافظ على قمم فصوص الرئة لأنها تعمل كعوامات أثناء خطوات التضمين اللاحقة والسماح بتضمين PVs أفقيا في مركب O.C.T.

4. تضمين الأنسجة

1. انقل المستحضر ، بما في ذلك LA و PVs ، إلى قالب تبريد ، مع التأكد من أن قاعدة القلب وقمة الرئة متجهتان لأعلى. رتبها في تكوين فسيولوجي - تأكد من أن PVs ليست ملتوية أو مقلوبة.
2. املأ cryomold بمركب O.C.T وضغط PVs برفق باستخدام ملقط ناعم لإزالة أي هواء متبقي. الحفاظ على تكوينها الفسيولوجي دون تغيير طوال العملية.
3. ضع cryomold مع الأنسجة المضمنة على الثلج الجاف لتجميد مركب O.C.T. . قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان إبقاء PVs في وضع أفقي لضمان الحصول على الأقسام التي تحتوي على PVs بالطول الكامل للإجراءات اللاحقة.

5. قطع وجمع أقسام الأنسجة المجمدة

ملاحظة: لقطع كتل الأنسجة ، تم ضبط إعدادات الماكينة على درجة حرارة عينة -18 درجة مئوية ، ودرجة حرارة الشفرة -25 درجة مئوية.

1. قم بتركيب كتلة نسيج على حامل العينة عن طريق تطبيق طبقة من مركب O.C.T. بين كتلة الأنسجة وحامل العينة. قم بتجميدها لمدة 3-4 دقائق.
2. قم بسد رأس العينة وقم بتحميل حامل العينة بكتلة الأنسجة الموجودة على رأس العينة عن طريق إغلاق ذراع تحرير ظرف العينة. اضبط موضع كتلة الأنسجة بدقة باستخدام مقابض الضبط الدقيقة.
3. إزالة cryomold من العينة. قم بإلغاء حظر رأس العينة والفرامل الكهربائية لجهاز التبريد.
4. اضبط cryostat على وضع القطع بحجم تقليم يتراوح بين 30 ميكرومتر و 50 ميكرومتر. تقليم عينة الأنسجة حتى تصبح PVs مرئية.
5. قم بالتبديل إلى وضع قطع المقطع الدقيق واضبط السماكة على 10 ميكرومتر. ابدأ في جمع الأقسام ، بما في ذلك PVs وأنسجة الرئة والأذينين المتصلة. اجمع المقاطع باستخدام لوحة مانعة للانزلاق أو عن طريق تثبيت الطرف الحر لكل قسم على حامل الشفرة بفرشاة باردة ناعمة وافردها.
6. ضع شريحة (محفوظة في درجة حرارة الغرفة) بجوار القسم. حرر القسم بعناية من الفرشاة ، مما يسمح للقسم بالالتصاق بشكل طبيعي بالشريحة ، حيث يذوب القسم المجمد ومركب O.C.T. عند لمس سطح الشريحة الأكثر دفئا.
   ملاحظة: حافظ على حالة مستقرة ولطيفة أثناء عملية التقسيم لمنع أي تمزق أو طيات في الأقسام. استبدل الشفرة بشفرة جديدة إذا لزم الأمر.
7. اجمع ما يصل إلى ثلاثة أقسام في كل شريحة. قم بتسمية الشرائح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: نوصي بجمع خمسة أقسام على الأقل (أي ما يعادل شريحتين) لكل PV.

6. تلطيخ التألق المناعي للأقسام المبردة من الخلايا الكهروضوئية

1. رتب الشرائح المجمدة على نظام تلطيخ واترك الأقسام تذوب لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: املأ نظام التلوين بالماء للحفاظ على ترطيب العينات. يمكن أن يؤدي تجفيف الأنسجة إلى إتلاف المستضدات ، مما يتسبب في ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة والبقع الزائدة أثناء إجراءات التلطيخ.
2. بعد 20 دقيقة من الذوبان ، قم بتغطية الأقسام ببضع قطرات من محلول التثبيت (4٪ بارافورمالدهيد [PFA] ، الجدول 1) لتثبيت الأنسجة على الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. بعد التثبيت ، انقل الشرائح إلى رف الشرائح العمودي واغمرها في حاوية مملوءة ب 1x PBS. ضع الحاوية على شاكر بسرعة منخفضة واغسل الشرائح لمدة 5 دقائق. كرر دورة الغسيل هذه مرتين أخريين ، باستخدام 1x PBS جديد في كل مرة.
4. بعد الغسيل ، ضع دائرة حول كل قسم على حدة في كل شريحة باستخدام قلم مانع للسوائل يحتوي على زيلول. أعد ترتيب الشرائح على نظام التلوين وقم بتطبيق 1 أو 2 قطرة من محلول النفاذية (0.1٪ Triton X-100 ، الجدول 1) على كل عينة باستخدام ماصة باستور. اترك الأقسام تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتخلل الخلية وأغشية عضيات الخلية.
5. بعد النفاذية ، قم بإزالة محلول Triton X-100 بنسبة 0.1٪ عن طريق غسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق في 1x PBS ، باتباع نفس الإجراء الموضح في الخطوة 6.3.
6. بعد الغسيل ، أعد ترتيب الشرائح على نظام التلوين وقم بتطبيق 1 أو 2 قطرات من المخزن المؤقت للحظر (الجدول 1) على كل قسم ، مع التأكد من تغطيتها بالكامل بالمخزن المؤقت للحظر. اسمح للشرائح بالاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. قم بإعداد 1 مل من مزيج الأجسام المضادة الأولية عن طريق سحب 5 ميكرولتر من الجسم المضاد ل cTNT للفأر (مخفف 1: 200) و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد للأرانب المضاد ل Cx43 (المخفف 1: 1,000) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مملوء ب 994 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر. ماصة الخليط لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل.
   ملاحظة: اضبط كمية خليط الأجسام المضادة المطبقة وفقا لحجم القسم. تأكد من أن الأقسام مغطاة بالكامل بخليط الأجسام المضادة. يمكن أن يختلف تركيز الأجسام المضادة ووقت الحضانة ودرجة حرارة الحضانة المثلى اعتمادا على عوامل مثل نوع الأجسام المضادة واستنساخ الأجسام المضادة وخصائص الأنسجة. نوصي باختبار وتحسين ظروف التلوين بشكل فردي لكل جسم مضاد.
8. بعد خطوة الحظر (الخطوة 6.6) ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي للحظر وقم بتطبيق 2 أو 3 قطرات من مزيج الأجسام المضادة الأولية مباشرة على كل قسم. اسمح للشرائح بالاحتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
9. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام Wash Buffer تحت الاهتزاز اللطيف (الجدول 1).
10. قم بإعداد 1 مل من مزيج الأجسام المضادة الثانوية عن طريق سحب 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للماعز المترافق AF488 (مخفف 1: 1,000) و 1 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي للأرانب الاقترانية AF568 (مخفف 1: 1,000) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مملوء ب 998 ميكرولتر من محلول الغسيل. ماصة الخليط صعودا وهبوطا لخلط جيدا.
11. بعد خطوة الغسيل (الخطوة 6.9) ، أعد ترتيب الشرائح في نظام التلوين وضع 2 أو 3 قطرات من خليط الأجسام المضادة الثانوي على كل قسم باستخدام ماصة. اسمح للأجسام المضادة بالاحتضان لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع حماية العينات من الضوء لمنع التبريد بالفلوروفور. بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام Wash Buffer تحت الاهتزاز اللطيف (الجدول 1).
12. إعادة ترتيب الشرائح على نظام تلطيخ. قم بموازنة الأقسام باستخدام Hoechst-33342 (بتخفيف 1: 1,000 في 1x PBS) عن طريق تطبيق 2 إلى 3 قطرات من محلول Hoechst-33342 على كل قسم. اترك الشرائح تحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
13. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح 3 × 5 دقائق باستخدام Wash Buffer تحت الهز اللطيف (الجدول 1). قم بتركيب الشرائح عن طريق تطبيق 1 أو 2 قطرات من وسيط تركيب الفلورسنت على كل شريحة. تغطية الشرائح مع أغطية الغطاء.
    ملاحظة: تأكد من أن غطاء الغطاء مسطح عند وضعه. في حالة وجود أي فقاعات هواء ، اضغط برفق على جانب الفقاعة لإزالتها.
14. قم بتخزين الشرائح المثبتة في موفر الشرائح عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يوصى بتصوير الشرائح في أقرب وقت ممكن. هذا البروتوكول ليس صالحا حصريا للأجسام المضادة المذكورة. يمكن استبدال المستضدات والأجسام المضادة المستهدفة أو تعديلها وفقا لمتطلبات التجربة الفردية أو استراتيجيات الكشف عن المستضد البديلة.

7. تصوير شرائح تلطيخ المناعي

1. قم بإعداد المجهر.
   1. ابدأ تشغيل المجهر باستخدام مصدر ضوء الليزر والكمبيوتر المتصل والبرامج المصاحبة باتباع دليل الشركة المصنعة.
   2. أدخل قائمة التكوين . انقر لتحديد نوع الكاميرا المناسب للتصوير الفلوري (على سبيل المثال ، كاميرا أحادية اللون DFC365FX).
   3. أدخل قائمة الاستحواذ وأنشئ ثلاث قنوات.
   4. حدد القناة FCr1 للكشف عن Hoechst-33342 ، وقم بتسميتها ، وحدد مكعب مرشح DAP في قسم التحديد . اضبط وقت التعرض على 200 مللي ثانية ، والكسب الإلكتروني على 2 ، وشدة الضوء على 17٪.
   5. حدد قناة FCr2 للكشف عن cTNT (ملطخة بجسم مضاد مقترن AF488) ، وقم بتسميتها ، وحدد مكعب مرشح L5 في قسم التحديد . اضبط وقت التعرض على 200-300 مللي ثانية ، والكسب الإلكتروني على 1.8 ، وشدة الضوء على 100٪.
   6. حدد قناة FCr3 للكشف عن Cx43 (ملطخة بجسم مضاد مقترن AF568) ، وقم بتسميتها ، وحدد مكعب مرشح TXR في قسم التحديد . اضبط وقت التعرض على 150 مللي ثانية ، والكسب الإلكتروني على 2 ، وشدة الضوء على 100٪.
      ملاحظة: الخصائص الطيفية لمكعبات المرشح مذكورة في الجدول 2.
2. قم بتحميل الشريحة على مرحلة المجهر.
3. قم بإجراء تصوير عام بتكبير 10x:
   1. حدد الهدف 10x وافتح غالق الليزر بالنقر فوق مباشر. مع تحديد قناة FCr1 ، استخدم وظيفة المتصفح للتنقل عبر الشريحة حتى يتم اكتشاف إشارة. ركز العينة تقريبا حتى يمكن تمييز نوى الخلية.
   2. ابدأ وضع المسح الحلزوني لالتقاط معاينة كاملة للعينة. قم بإلغاء تنشيط البث المباشر بالنقر فوق الزر مرة أخرى لحماية العينة. تحديد LA و PVs وأنسجة الرئة.
   3. تحديد مجال الاهتمام لمسح البلاط اللاحق ؛ حدد نقاط تركيز متعددة داخل مجال الاهتمام. انقر فوق مباشر في قناة FCr1 واضبط التركيز لكل نقطة تركيز بؤري. احفظ مواضع Z المناظرة، والتي تمثل موضع التركيز البؤري الدقيق لكل نقطة تركيز بؤري. ابدأ مسح التجانب بتكبير 10x لالتقاط صورة نظرة عامة كاملة للعينة.
   4. بعد اكتمال الفحص ، افتح مسح التجانب وادمج الصور الفردية. لتحسين سطوع وتباين القنوات الفردية ، حددها في شريط الكائن واضبط نطاق الإشارة باستخدام أشرطة التمرير حسب الرغبة.
4. الحصول على صور مكبرة بتكبير 40x :
   1. حدد الهدف 40x. اضبط وقت التعرض وإعدادات الكسب لكل قناة على النحو التالي: FCr1: مكعب مرشح DAP: وقت التعرض: 50 مللي ثانية ، الكسب: 1.5 ؛ FCr2: مكعب مرشح L5: وقت التعرض: 80 مللي ثانية ، الكسب: 1.8 ؛ FCr3: مكعب مرشح TXR: وقت التعرض: 20 مللي ثانية ، الكسب: 2.
   2. استخدم صورة النظرة العامة للخطوة 7.3 لتحديد موقع فتحة PV (PVO) ، بالإضافة إلى مناطق PV خارج الرئة وداخل الرئة (PV_ex ،_{PV in}). حدد هذه المنطقة المراد مسحها ضوئيا.
   3. افتح القائمة الفرعية Image وانقر على z لتنشيط Z-Stack.
      1. حدد قناة FCr1 وافتح غالق الليزر للحصول على معاينة مباشرة .
      2. انتقل إلى القائمة الفرعية Z-Stack وحدد نقاط البداية والنهاية Z-Stack عن طريق تدويرمقبض الضبط الدقيق f ocus في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة حتى تبدأ الإشارة الإجمالية في فقدان التركيز.
      3. بعد إعداد نطاق التركيز البؤري ، حدد وضع Z-Stack المحسن للنظام ، وقم بتنشيط خيار حساب العمق الممتد لصور المجال (EDF). اعتمادا على مدى سطح الأنسجة ، توقع ما يقرب من 20 طبقة مع فاصل زمني يبلغ حوالي 0.5 ميكرومتر.
   4. ابدأ فحص التجانب. بعد المسح ، افتح فحص التجانب وادمج صورة EDF فقط. لتحسين سطوع وتباين القنوات الفردية ، حددها في شريط الكائن واضبط نطاق الإشارة الخاص بها باستخدام أشرطة التمرير حسب الرغبة (انظر الخطوة 7.3.4).
5. بعد إنشاء الصور ، احفظ المشروع وقم بتصدير كل من الإصدار المدمج والقنوات الأولية لكل صورة كملف TIFF.
   ملاحظة: يسمح حفظ الملفات بتنسيق TIFF قابل للقراءة في ImageJ ل ImageJ باستيراد حجم التجانب الأصلي بالميكرومتر بدلا من وحدات البكسل. أغلق دائما مصراع الليزر كلما لم تكن هناك حاجة إلى إشارة ليزر لمنع التبييض الضوئي للأجسام المضادة الثانوية.

8. تحرير الصور باستخدام ImageJ

1. قم بتحميل ملفات القناة الأولية المقابلة في ImageJ. انقر على الصورة | اللون | دمج واختيار اللون المطلوب لكل قناة.
2. إنشاء شريط مقياس عن طريق تحديد تحليل | أدوات | مقياس الشريط ولصقه في الزاوية اليمنى السفلى. تابع المزيد من المعالجة والتحليل وفقا لمتطلبات الصورة. احفظ الصور المدمجة عند الانتهاء.

النتائج

أجرينا التشريح المجهري ، وتلطيخ ، وتصوير PVs في 10 فئران عمرها 12-16 أسبوعا. باتباع البروتوكول ، نجحنا في تشريح PVs مع LA في جميع فئران التجارب وحصلنا على أقسام مع رؤية شاملة لل PVs في ثمانية فئران. تم التقاط صور عامة بتكبير 10x لتحديد منطقة الفتحة الكهروضوئية (PVO) عند تقاطع LA-PV ، والخلايا الكهروضوئية خ...

Discussion

باستخدام هذا البروتوكول ، نشارك طريقة لتمييز وعزل PVs لقلب الفأر وإجراء تلطيخ مناعي عليها. بعد حصاد الأعضاء ، تم تجفيف القلب والرئتين في محلول سكروز معقم ، يليه فصل البطينين عن الأذين وفصوص الرئة تحت التوجيه المجهري. بعد ذلك ، تم إعداد قاعدة القلب لتصور الخلايا الكهروضوئية متبوعة بقطعها من ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287