ألياف عضلية هيكلية قصيرة ومتوسطة وطويلة سليمة تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لست عضلات خلفية للفئران: Beyond Flexor digitorum brevis

Summary

وصفنا بروتوكولا للحصول على ألياف منفصلة إنزيميا بأطوال وأنواع مختلفة من ست عضلات للفئران البالغة: ثلاثة منها موصوفة بالفعل (flexor digitorum brevis ، extensor digitorum longus ، soleus) وثلاثة منها انفصلت بنجاح لأول مرة (الباسطة الهلوسة الطويلة ، peroneus longus ، peroneus digiti quarti).

Abstract

ألياف العضلات الهيكلية التي تم الحصول عليها عن طريق التفكك الأنزيمي لعضلات الماوس هي نموذج مفيد للتجارب الفسيولوجية. ومع ذلك ، فإن معظم الأوراق تتعامل مع الألياف القصيرة من flexor digitorum brevis (FDB) ، والتي تقيد نطاق النتائج التي تتعامل مع أنواع الألياف ، وتحد من كمية المواد البيولوجية المتاحة ، وتعيق وجود صلة واضحة بين الظواهر الفسيولوجية الخلوية والمعرفة البيوكيميائية والديناميكية السابقة التي تم الحصول عليها في العضلات الأخرى.

تصف هذه الورقة كيفية الحصول على ألياف سليمة من ست عضلات ذات ملامح وأطوال مختلفة من نوع الألياف. باستخدام الفئران البالغة C57BL / 6 ، نعرض تشريح العضلات وبروتوكول عزل الألياف ونوضح مدى ملاءمة الألياف للدراسات العابرة Ca²⁺ وتوصيفها المورفومتري. كما يتم تقديم تكوين نوع الألياف للعضلات. عند الانفصال ، تصبح جميع العضلات سليمة ، والألياف الحية التي تنقبض بسرعة لأكثر من 24 ساعة. أعطى FDB قصيرة (<1 مم) ، Peroneus digiti quarti (PDQA) و peroneus longus (PL) أعطت وسيطة (1-3 مم) ، بينما الباسطة digitorum longus (EDL) ، الهلوسة الباسطة الطويلة (EHL) ، والعضلات الوحيدة تطلق أليافا طويلة (3-6 مم).

عند تسجيلها باستخدام الصبغة السريعة Mag-Fluo-4 ، أظهرت عابرات Ca²⁺ من ألياف PDQA و PL و EHL الحركية السريعة والضيقة التي تذكرنا بالنوع المورفولوجي II (MT-II) ، المعروف أنه يتوافق مع ألياف النوع IIX و IIB. هذا يتوافق مع حقيقة أن هذه العضلات لديها أكثر من 90 ٪ من الألياف من النوع الثاني مقارنة مع FDB (~ 80 ٪) و soleus (~ 65 ٪). بالانتقال إلى ما بعد FDB ، نظهر لأول مرة تفكك العديد من العضلات ، مما يجعل الألياف تمتد على نطاق من الأطوال بين 1 و 6 مم. هذه الألياف قابلة للحياة وتعطي عابرات Ca²⁺ سريعة ، مما يشير إلى أنه يمكن تعميم MT-II على ألياف IIX و IIB السريعة ، بغض النظر عن مصدر عضلاتها. تزيد هذه النتائج من توافر نماذج لدراسات العضلات الهيكلية الناضجة.

Introduction

العضلات الهيكلية الناضجة للثدييات هي نسيج متعدد الوظائف. ينظم بشكل كبير عملية التمثيل الغذائي ، وهو المصدر الرئيسي لإنتاج الحرارة ، وتمنحه خصائصه الديناميكية دورا رئيسيا في التنفس أو حركة أجزاء الجسم أو الإزاحة من نقطة إلى^{أخرى 1،2،3}. العضلات الهيكلية ذات صلة أيضا بالفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض ، بما في ذلك الحالات الوراثية والمزمنة ، مثل الاعتلالات العضلية أو الحثل أو ساركوبينيا ، بالإضافة إلى العديد من الحالات المزمنة غير العضلية ، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية^3،4،5....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة الأخلاقيات في التجارب مع بجامعة أنتيوكيا (UdeA) (المحضر 104 المؤرخ 21 يونيو 2016 و 005 المؤرخ 15 أبريل 2021^{) ، وفقا} للقانون 84 لعام 1989 والقرار 8430 لعام 1993 الصادر عن الحكومة الكولومبية وتم إجراؤها والإبلاغ عنها وفقا للبحوث الحيوانية: إرشادات إعداد التقارير في تجارب الجسم الحي (ARRIVE)⁴¹. جميع النتائج المعروضة هنا تأتي من الفئران السليمة ، التي تتراوح أعمارها بين 7 و 13 أسبوعا ، و 20-26 جم ، و C57BL / 6 ذكور. يوضح الشكل 1 التصميم العام لهذه الدراسة وترتيب الإجراءات. يتم سرد جميع تفاصيل الكواشف والمواد والمعدات في جدول المواد

النتائج

تركيز الساركوبلازم^{Ca 2+} أثناء الارتعاش
لإثبات جدوى التجارب الفسيولوجية في مجموعة الألياف المنفصلة ولتوسيع نتائجنا السابقة حول اقتران الإثارة والانكماش (ECC) وأنواع الألياف ، تم الحصول على Ca²⁺ transients في الألياف من جميع العضلات. أولا ، أظهر FDB (n = 5) و EDL (n = 7) حركية Ca²⁺ ا?.......

Discussion

لاستكمال النماذج المتاحة لدراسة بيولوجيا العضلات الهيكلية الناضجة ، نوضح هنا التفكك الأنزيمي الناجح لمجموعة من عضلات الفئران ذات الألياف القصيرة والمتوسطة والطويلة. تسمح هذه الألياف بإظهار قابلية تعميم حركية MT-II للعابرين Ca²⁺ في العضلات الهيكلية. علاوة على ذلك ، تم تصنيف أنواع الأل?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Absolute ethanol	Sigma Aldrich	32221
Acetone	Merck	179124
Acrylamide	Gibco BRL	15512-015
Ammonium persulfate	Panreac	141138.1610
Anti myosin I antibody	Sigma Aldrich	M4276	Primary antibody
Anti myosin II antibody	Sigma Aldrich	M8421	Primary antibody
Anti myosin IIA antibody	American Type Culture Collection	SC-71	Primary antibody. Derived from HB-277 hybridoma
Anti myosin IIB antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	BF-F3-c	Primary antibody
Bis-acrylamide	AMRESCO	0172
Bovine serum albumin	Thermo Scientific	B14
Bradford reagent	Merck	1.10306.0500
Bromophenol blue	Carlo Erba	428658
Calcium carbonate	Merck	102066
Calcium dichloride (CaCl2)	Merck	2389
Chloroform	Sigma Aldrich	319988
Collagenase type 2	Worthington	CLS-2/LS004176
Consul-Mount	Thermo Scientific	9990440
Coomassie Brilliant blue R 250	Merck	112553
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dithiothreitol (DTT)	AMRESCO	0281
Edetic acid (EDTA	AMRESCO	0322
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
Glycerol	Panreac	1423291211
Glycine	Panreac	151340.1067
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023
Hematoxylin	Thermo Scientific	6765015
HEPES	AMRESCO	0511
Hoechst 33258	Sigma Aldrich	861405
Imidazole	AMRESCO	M136
Isopentane	Sigma Aldrich	M32631
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
Mag-Fluo-4, AM	Invitrogen	M14206	Prepared only in DMSO. Pluronic acid is not required and should not be used to avoid fiber deterioration.
Mercaptoethanol	Applichem	A11080100
Methanol	Protokimica	MP10043
Mice	Several	Several	For this manuscript, we only used C57BL/6 mice. However, some preliminary results have shown that the protocol works well for Swiss Webster mice of the same age and weight.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Promega	V3161
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS)	Tocris	1870
Optimal cutting compound (OCT)	Thermo Scientific	6769006
Secondary antibody	Thermo Scientific	A-11001	Goat anti-mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Sodium dodecil sulfate	Panreac	1323631209
TRIS 0.5 M, pH 6.8	AMRESCO	J832
Tris(Hydroxymethyl)aminomethane	AMRESCO	M151
Triton X-100	AMRESCO	M143
Materials
Dissection chamber	Custom-made
Charged slides	Erie Scientific	5951PLUS
Experimental bath chamber	Warner Instruments	RC-27NE2	Narrow Bath Chamber with Field Stimulation, ensembled on a heated platform PH-6
Fine forceps	World Precision Instruments	500338, 500230
Fine scissors	World Precision Instruments	Vannas Scissors 501778
Glass Pasteur pipettes	Several		Fire-polished tips
Glass vials with cap	Several		2-3 mL volumen
Operating scissors	World Precision Instruments	501223-G
Equipment
Centrifuge	Thermo Scientific	SL 8R
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Cryostat	Leica	CM1850
Digital camera	Zeiss	Erc 5s and Axio 305	Axio 305, coupled to the Stemi 508 stereoscope, was used to take pictures during dissection; while Erc 5s or Axio 208, coupled to the Axio Observer A1 microscope, were used to take images of the isolated fibers and the immunofluorescence assays
Digitizer	Molecular Devices	1550A Digidata
Electrophoresis chamber	Bio Rad	Mini-Protean IV
Inverted microscope coupled to fluorescence	Zeiss	Axio Observer A1	Coupled to an appropriate light source, filters and objectives for fluorescence
Photomultiplier	Horiba	R928 tube, Hamamatsu, in a D104 photometer, Horiba	Coupled to the lateral port of the fluorescence microscope
Stereoscope	Zeiss	Stemi 508
Stimulator	Grass Instruments	S6
Water bath	Memmert	WNE-22
Xilol	Sigma Aldrich	808691
Software
Free software for electrophoreses analyses	University of Kentucky	GelBandFitter v1.7	http://www.gelbandfitter.org
Free software for image analysis and morphometry	National Institutes of Health	ImageJ v1.54	https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licensed software for Ca2+ signals acquisition and analyses	Molecular Devices	pCLAMP v10.05	https://www.moleculardevices.com
Licensed software for statistical analyses and graphing	OriginLab	OriginPro 2019	https://www.originlab.com/