اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتقييم ما إذا كانت EVs الصغيرة (sEVs) المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل الحاجز الدموي الدماغي في إناث الفئران البالغة غير الحوامل.

Abstract

وتشكل المضاعفات الدماغية الوعائية، بما في ذلك الوذمة الدماغية والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية، السبب الرئيسي لوفيات الأمهات المرتبطة بمقدمات الارتعاج. الآليات الكامنة وراء هذه المضاعفات الدماغية الوعائية لا تزال غير واضحة. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بخلل المشيمة واضطراب حاجز الدم في الدماغ (BBB). ومع ذلك ، لا يزال يتم تحديد العلاقة بين هذين الجهازين البعيدين. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المشيمة تطلق جزيئات الإشارة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية ، في الدورة الدموية للأم. يتم تصنيف الحويصلات خارج الخلية وفقا لحجمها ، مع الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs أصغر من 200 نانومتر في القطر) تعتبر جزيئات إشارات حرجة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في تسمم الحمل ، هناك عدد متزايد من sEVs المتداولة في الدورة الدموية للأمهات ، والتي لا يتم فهم وظيفة الإشارة إليها جيدا. تحفز التشوهات المشيمية التي يتم إطلاقها في مقدمات الارتعاج أو من مشيمة الحمل الطبيعية المعرضة لنقص الأكسجة الخلل البطاني في الدماغ وتعطيل BBB. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم ما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل BBB في الجسم الحي.

Introduction

ما يقرب من 70 ٪ من وفيات الأمهات بسبب تسمم الحمل ، ومتلازمة الحمل ارتفاع ضغط الدم التي تتميز بضعف عمليات المشيمة ، والخلل البطاني الجهازي للأم ، وفي الحالات الشديدة ، الفشل متعدد الأعضاء^1،2 ، ترتبط بمضاعفات الأوعية الدموية الدماغية الحادة ^3,4. تحدث معظم وفيات الأمهات في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل⁵. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة على الرغم من الأهمية السريرية والوبائية للمضاعفات الدماغية الوعائية المرتبطة بتسمم الحمل.

من ناحية أخرى ، تعد الحويصلات خارج الخلية (EVs) (القطر ~ 30-400 ن....

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ المعبر عنها في إعلان هلسنكي وبإذن من مجالس المراجعة الأخلاقية المعنية. أعطى جميع المشاركين من البشر موافقتهم المستنيرة قبل جمع العينات ، كما ورد سابقا²⁵. وبالإضافة إلى ذلك، وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا والسلامة البيولوجية التابعة لجامعة بيو - بيو على هذا المشروع (منحة Fondecyt 1200250). تم إجراء العمل الحيواني وفقا للمبادئ الأساسية للثلاثة R في استخدام في التجربة³⁵ ، ووفقا لتوصيات المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام المختبر التي نشرها المعهد الوطني الأمريكي للصحة. تم الاحتفاظ بالحيوانات في بيئات مناسبة في بيت بجامعة بيو بيو. تم الحصول على المشيمة الطازجة (ن = 4) في غضون 1 ساعة بعد العملية القي....

النتائج

يقيم هذا البروتوكول قدرة sEVs المشتقة من المشيمة المزروعة في نقص الأكسجة على تعطيل BBB في الفئران غير الحوامل. تسمح هذه الطريقة للمرء بفهم أفضل للعلاقة المحتملة بين المشيمة والدماغ في الظروف الطبيعية والمرضية. على وجه الخصوص ، قد تشكل هذه الطريقة وكيلا لتحليل مشاركة sEVs المشيمة في بداية المضا.......

Discussion

تكشف هذه الدراسة النقاب عن رؤى جديدة حول الضرر المحتمل الناتج عن sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظروف نقص الأكسجين على اضطراب حاجز الدم في دماغ القوارض. تتضمن الآلية المرضية انخفاضا في CLND-5 في منطقة الدماغ الخلفية²⁵.

كشفت التحقيقات السابقة أن البلازما .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult mice brain slecer matrice 3D printed	Open access file	Adult mice	Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody	Sigma-Aldrich	Clon AC-74	Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody	Santa cruz Biotechnology	sc-374221	Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit	Thermo Scientific	23225	Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator	RWD Life science	D180	Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX	Himac eppendorf group	5720410101	Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL	USP Baxter	212-094	Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive	Promega	0000105232	In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	MO 63103	Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller	BioSpherix	SCR_021131	CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g	Chemie	7061	humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system	Kent Scientifics	SS-01	Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform	Kent Scientifics	A41166	Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm	Southern labware	10026	Filtration of condicioned media harvested from placental explants
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE	Hitachi medical systems	6020	Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x	Center Medical	2597	Stereomicroscope to register brain slices