A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نصف طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

Abstract

يؤدي الجهاز الهضمي (GI) مجموعة من الوظائف الأساسية للحياة. يمكن أن تؤدي العيوب الخلقية التي تؤثر على تطورها إلى اضطرابات عصبية عضلية معوية ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب للحصول على خلايا حية قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). يعتمد هذا البروتوكول على التشريح اليدوي لأمعاء الزرد ، يليه التفكك الأنزيمي مع غراء. بعد ذلك ، يتم تقديم الخلايا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، ويتم جمع الخلايا القابلة للحياة من أجل scRNA-seq. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المعوية المختلفة بنجاح ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، وكذلك الخلايا العصبية المعوية والدبقية. لذلك ، نعتبره موردا قيما لدراسة تكوين الجهاز الهضمي في الصحة والمرض ، باستخدام الزرد.

Introduction

الجهاز الهضمي (GI) هو نظام معقد يلعب دورا حيويا في الصحة العامة والرفاهية. وهي مسؤولة عن هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، وكذلك القضاء على النفايات 1,2. يتكون الجهاز الهضمي من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية والجهاز العصبي المعوي (ENS) ، والتي تتواصل بشكل وثيق معا لتنظيم وظيفة الأمعاء المناسبة والحفاظ عليها3،4،5. يمكن أن يكون للعيوب في تطور الجهاز الهضمي آثار بعيدة المدى على جوانب مختلفة مثل امتصاص العناصر الغذائية ، وتكوين الجراثيم ، ومحور الأمعاء والدماغ ،....

Protocol

تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لتشريع Erasmus MC ورعاية. يندرج استخدام يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ضمن فئة التجارب التي لا تتطلب موافقة أخلاقية رسمية ، على النحو المبين في اللوائح الهولندية.

1. الحصول على 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) من النوع البري ويرقات tg (phox2bb: GFP)

  1. قم بإعداد تربية الزرد من النوع البري وجمع 50 بيضة في وسط E3 المخزن HEPES (المشار إليه فيما يلي باسم E3) في طبق بتري 15 سم. استخدم هذه الأسماك كعنصر تحكم سلبي لفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACs).
  2. قم بإعداد تربية سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) وجمع ما يقرب من 300 بيضة في E3 في ط....

النتائج

مع هذا البروتوكول ، حققنا عزلا ناجحا وتفككا للأمعاء بأكملها من 5 يرقات dpf. باستخدام غراء كإنزيم تفكك ، عززنا بشكل كبير صلاحية الخلية ، مما مكن من التقاط 46139 حدثا يتضمن خلايا مفردة قابلة للحياة (6.4٪ من جميع الخلايا) من أصل 244 أمعاء معزولة (الشكل 2 أ). تم استخدام اليرقات الكاملة من.......

Discussion

هنا ، نقدم طريقة لعزل وتفكك أمعاء 5 يرقات الزرد dpf باستخدام FACS. باستخدام هذه الطريقة ، تم جمع أنواع مختلفة من الخلايا المعوية وتحليلها بنجاح بواسطة scRNA-seq ، باستخدام منصة 10x Genomics Chromium. اخترنا خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، حيث أردنا مؤشرا على أن خلايا ENS القابلة للحياة ستكون معزولة أيضا (.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل أصدقاء مؤسسة صوفيا (SSWO WAR-63).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)Sigma59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer capFalcon352235
AgaroseSigma-AldrichA9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap capBD Biosciences352054
Cell Ranger v3.0.210X GenomicsN/A
DAPISigma-AldrichCat#D-9542
Dissection microscopeOlympus SZX16
FACSAria III sorter machineBD BiosciencesN/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2Gibco14025050
Insect pinsFine Science Tools26000-25
L-CysteineSigmaC7352
MS-222, TricaineSupelcoA5040-250G
PapainSigmaP4762
Seurat v3Stuart et al. (2019)N/A
Trypan blue Sigma Cat#T8154

References

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. .

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved