عزل الأمعاء من يرقات الزرد لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

Summary

هنا ، نصف طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

Abstract

يؤدي الجهاز الهضمي (GI) مجموعة من الوظائف الأساسية للحياة. يمكن أن تؤدي العيوب الخلقية التي تؤثر على تطورها إلى اضطرابات عصبية عضلية معوية ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب للحصول على خلايا حية قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). يعتمد هذا البروتوكول على التشريح اليدوي لأمعاء الزرد ، يليه التفكك الأنزيمي مع غراء. بعد ذلك ، يتم تقديم الخلايا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، ويتم جمع الخلايا القابلة للحياة من أجل scRNA-seq. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المعوية المختلفة بنجاح ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، وكذلك الخلايا العصبية المعوية والدبقية. لذلك ، نعتبره موردا قيما لدراسة تكوين الجهاز الهضمي في الصحة والمرض ، باستخدام الزرد.

Introduction

الجهاز الهضمي (GI) هو نظام معقد يلعب دورا حيويا في الصحة العامة والرفاهية. وهي مسؤولة عن هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، وكذلك القضاء على النفايات ^1,2. يتكون الجهاز الهضمي من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية والجهاز العصبي المعوي (ENS) ، والتي تتواصل بشكل وثيق معا لتنظيم وظيفة الأمعاء المناسبة والحفاظ عليها^3،4،5. يمكن أن يكون للعيوب في تطور الجهاز الهضمي آثار بعيدة المدى على جوانب مختلفة مثل امتصاص العناصر الغذائية ، وتكوين الجراثيم ، ومحور الأمعاء والدماغ ،....

Protocol

تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لتشريع Erasmus MC ورعاية. يندرج استخدام يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ضمن فئة التجارب التي لا تتطلب موافقة أخلاقية رسمية ، على النحو المبين في اللوائح الهولندية.

1. الحصول على 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) من النوع البري ويرقات tg (phox2bb: GFP)

1. قم بإعداد تربية الزرد من النوع البري وجمع 50 بيضة في وسط E3 المخزن HEPES (المشار إليه فيما يلي باسم E3) في طبق بتري 15 سم. استخدم هذه الأسماك كعنصر تحكم سلبي لفرز الخلايا المنشطة بالتألق (FACs).
2. قم بإعداد تربية سمك الزرد tg (phox2bb: GFP) وجمع ما يقرب من 300 بيضة في E3 في ط....

النتائج

مع هذا البروتوكول ، حققنا عزلا ناجحا وتفككا للأمعاء بأكملها من 5 يرقات dpf. باستخدام غراء كإنزيم تفكك ، عززنا بشكل كبير صلاحية الخلية ، مما مكن من التقاط 46139 حدثا يتضمن خلايا مفردة قابلة للحياة (6.4٪ من جميع الخلايا) من أصل 244 أمعاء معزولة (الشكل 2 أ). تم استخدام اليرقات الكاملة من.......

Discussion

هنا ، نقدم طريقة لعزل وتفكك أمعاء 5 يرقات الزرد dpf باستخدام FACS. باستخدام هذه الطريقة ، تم جمع أنواع مختلفة من الخلايا المعوية وتحليلها بنجاح بواسطة scRNA-seq ، باستخدام منصة 10x Genomics Chromium. اخترنا خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، حيث أردنا مؤشرا على أن خلايا ENS القابلة للحياة ستكون معزولة أيضا (.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154