A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
هنا ، نصف طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ، لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
يؤدي الجهاز الهضمي (GI) مجموعة من الوظائف الأساسية للحياة. يمكن أن تؤدي العيوب الخلقية التي تؤثر على تطورها إلى اضطرابات عصبية عضلية معوية ، مما يسلط الضوء على أهمية فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور الجهاز الهضمي والخلل الوظيفي. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة لعزل الأمعاء من يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب للحصول على خلايا حية قابلة للحياة والتي يمكن استخدامها لتحليل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq). يعتمد هذا البروتوكول على التشريح اليدوي لأمعاء الزرد ، يليه التفكك الأنزيمي مع غراء. بعد ذلك ، يتم تقديم الخلايا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ، ويتم جمع الخلايا القابلة للحياة من أجل scRNA-seq. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد أنواع الخلايا المعوية المختلفة بنجاح ، بما في ذلك الخلايا الظهارية واللحمية والدم والعضلات والخلايا المناعية ، وكذلك الخلايا العصبية المعوية والدبقية. لذلك ، نعتبره موردا قيما لدراسة تكوين الجهاز الهضمي في الصحة والمرض ، باستخدام الزرد.
الجهاز الهضمي (GI) هو نظام معقد يلعب دورا حيويا في الصحة العامة والرفاهية. وهي مسؤولة عن هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، وكذلك القضاء على النفايات 1,2. يتكون الجهاز الهضمي من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الظهارية وخلايا العضلات الملساء والخلايا المناعية والجهاز العصبي المعوي (ENS) ، والتي تتواصل بشكل وثيق معا لتنظيم وظيفة الأمعاء المناسبة والحفاظ عليها3،4،5. يمكن أن يكون للعيوب في تطور الجهاز الهضمي آثار بعيدة المدى على جوانب مختلفة مثل امتصاص العناصر الغذائية ، وتكوين الجراثيم ، ومحور الأمعاء والدماغ ،....
تم إجراء جميع عمليات تربية الزرد والتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لتشريع Erasmus MC ورعاية. يندرج استخدام يرقات الزرد في 5 أيام بعد الإخصاب ضمن فئة التجارب التي لا تتطلب موافقة أخلاقية رسمية ، على النحو المبين في اللوائح الهولندية.
1. الحصول على 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) من النوع البري ويرقات tg (phox2bb: GFP)
مع هذا البروتوكول ، حققنا عزلا ناجحا وتفككا للأمعاء بأكملها من 5 يرقات dpf. باستخدام غراء كإنزيم تفكك ، عززنا بشكل كبير صلاحية الخلية ، مما مكن من التقاط 46139 حدثا يتضمن خلايا مفردة قابلة للحياة (6.4٪ من جميع الخلايا) من أصل 244 أمعاء معزولة (الشكل 2 أ). تم استخدام اليرقات الكاملة من.......
هنا ، نقدم طريقة لعزل وتفكك أمعاء 5 يرقات الزرد dpf باستخدام FACS. باستخدام هذه الطريقة ، تم جمع أنواع مختلفة من الخلايا المعوية وتحليلها بنجاح بواسطة scRNA-seq ، باستخدام منصة 10x Genomics Chromium. اخترنا خط الزرد tg (phox2bb: GFP) ، حيث أردنا مؤشرا على أن خلايا ENS القابلة للحياة ستكون معزولة أيضا (.......
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
تم تمويل هذا العمل من قبل أصدقاء مؤسسة صوفيا (SSWO WAR-63).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
Papain | Sigma | P4762 | |
Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved