JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تتطلب الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية لناقلات الأغشية البشرية كميات ملليغرام من البروتين المستقر والسليم والمتجانس. نصف هنا الطرق القابلة للتطوير لفحص ناقلات ناقلات المذاب البشري والتعبير عنها وتنقيتها باستخدام الجينات المحسنة للكودون.

Abstract

ناقلات المذاب (SLCs) هي ناقلات غشائية تستورد وتصدر مجموعة من الركائز الداخلية والخارجية ، بما في ذلك الأيونات والمغذيات والمستقلبات والناقلات العصبية والمستحضرات الصيدلانية. على الرغم من ظهورها كأهداف علاجية جذابة وعلامات للمرض ، إلا أن هذه المجموعة من البروتينات لا تزال تعاني من نقص الأدوية نسبيا من قبل الأدوية الحالية. يتم إعاقة مشاريع اكتشاف الأدوية لهذه الناقلات بسبب المعرفة الهيكلية والوظيفية والفسيولوجية المحدودة ، ويرجع ذلك في النهاية إلى الصعوبات في التعبير عن هذه الفئة من البروتينات المضمنة في الغشاء وتنقيتها. نوضح هنا طرقا للحصول على كميات عالية النقاء وملليغرام من بروتينات ناقل SLC البشرية باستخدام تسلسلات جينية محسنة للكودون. بالاقتران مع الاستكشاف المنهجي لتصميم البناء والتعبير عالي الإنتاجية ، تضمن هذه البروتوكولات الحفاظ على السلامة الهيكلية والنشاط الكيميائي الحيوي للبروتينات المستهدفة. نسلط الضوء أيضا على الخطوات الحاسمة في تعبير الخلايا حقيقية النواة ، وتنقية التقارب ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم لهذه البروتينات. في النهاية ، ينتج عن سير العمل هذا مستحضرات بروتينية نقية ونشطة وظيفيا ومستقرة مناسبة لتحديد البنية عالية الدقة ، ودراسات النقل ، ومقايسات مشاركة الجزيئات الصغيرة ، والفحص عالي الإنتاجية في المختبر .

Introduction

لطالما كانت البروتينات الغشائية أهدافا للباحثين والصناعات الدوائية على حد سواء. من بين هؤلاء ، فإن ناقلات المذاب (SLCs) هي عائلة تضم أكثر من 400 جين ناقل ثانوي مشفر داخل الجينوم البشري1. تشارك هذه الناقلات في استيراد وتصدير العديد من الجزيئات ، بما في ذلك الأيونات2 ، والناقلات العصبية3 ، والدهون4،5،6،7 ، والأحماض الأمينية8 ، والمغذيات9،10،11 ، والمستحضرات الصيدلانية 12. مع هذا الاتساع في الركائز ، فإن هذه البروتينات متورطة أيضا في مجموعة من الفيزيولوجيا المرضية من خلال نقل السموم13 ، أو نقل وتثبيط تعاطي المخدرات 14،15 ، أو الطفرات الضارة16. كانت المتجانسات البكتيرية بمثابة نماذج أولية لآلية النقل الأساسية للعديد من عائلات SLC17،18،19،20،21،22،23،24،25. على عكس البروتينات البشرية ، غالبا ما يتم التعبير عن تقويم بدائيات النواة بشكل أفضل في نظام تعبير الإشريكية القولونية المفهوم جيدا 26,27 وتكون أكثر استقرارا في المنظفات الأصغر التي تنتج بلورات مرتبة جيدا لعلم البلورات بالأشعة السينية28. ومع ذلك ، فإن التسلسل والاختلافات الوظيفية تعقد استخدام هذه البروتينات ذات الصلة البعيدة لاكتشاف الأدوية29,30. وبالتالي ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى دراسة مباشرة للبروتين البشري لفك آلية عمل الأدوية التي تستهدف SLCs31،32،33،34،35. في حين أن التطورات الحديثة في الفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد (Cryo-EM) قد مكنت من التوصيف الهيكلي ل SLCs في ظروف أكثر شبها بالسكانالأصليين 36،37 ، فإن صعوبة التعبير عن هذه البروتينات وتنقيتها لا تزال تمثل تحديا لتطوير العلاجات والتشخيصات المستهدفة.

للتخفيف من هذا التحدي ، طور اتحاد RESOLUTE (re-solute.eu) موارد وبروتوكولات للتعبير على نطاق واسع وتنقية البروتينات البشريةمن عائلة SLC 38. بدءا من الجينات المحسنة للكودون ، قمنا بتطوير طرق للاستنساخ عالي الإنتاجية وفحص تركيبات SLC. تم تطبيق هذه الطرق بشكل منهجي على عائلة SLCs بأكملها ، وتم استنساخ الجينات في نظام التعبير الفيروسي BacMam ، وتم اختبار تعبير البروتين في خطوط الخلايا البشرية39 بناء على الطرق الموصوفة سابقا للاستنساخ عالي الإنتاجية واختبار التعبير40. باختصار ، يتم استنساخ جين SLC من بلازميد pDONR221 إلى ناقل pHTBV1.1. يستخدم هذا البناء لاحقا لنقل الجين محل الاهتمام إلى ناقل bacmid لنقل خلايا الحشرات ، والذي يتضمن محفزا للفيروس المضخم للخلايا وعناصر محسن للتعبير في خلايا الثدييات. يمكن استخدام الفيروس البقعي الناتج لتحويل خلايا الثدييات للتعبير عن بروتين SLC المستهدف.

كما طورنا طرقا موحدة للتعبير على نطاق واسع والتنقية المستقرة ل SLCs المختارة (الشكل 1). يتضمن هذا البروتوكول نقاط تفتيش متعددة لتسهيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل فعال وتقليل التباين بين التجارب. والجدير بالذكر أن المراقبة الروتينية لتعبير البروتين وتوطينه ، بالإضافة إلى تحسين ظروف التنقية على نطاق صغير للأهداف الفردية ، قد ساعدتها علامات Strep و Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

في نهاية المطاف ، يمكن استخدام عينات البروتين النقية كيميائيا والمتجانسة هيكليا للتحديد الهيكلي عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (Cryo-EM) ، ومقايسات المشاركة في الهدف البيوكيميائية ، والتحصين لتوليد المواد الرابطة ، والدراسات الوظيفية الخالية من الخلايا عن طريق إعادة التكوين إلى الجسيمات الشحمية المحددة كيميائيا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تم إيداع جميع جينات RESOLUTE SLC المحسنة للكودون في AddGene43 ، والتي تتوفر روابطها في قائمة الكواشف العامة الحازمة44. تم استنساخ هذه الجينات في بلازميد pDONR221 وتسمح بالاستنساخ المباشر للجينات في ناقل الوجهة باستخدام استنساخ إعادة التركيب45. لتحقيق أقصى قدر من التوازي ، تزرع الخلايا البكتيرية والحشرية والثدييات في شكل كتلة لإنتاج bacmid (القسم 3) ، وتضخيم الفيروس البقعي (القسم 5) ، واختبار التعبير (القسم 6) ، على التوالي. لهذه الخطوات ، يلزم وجود شاكر تعبير دقيق لضمان الخلط والتهوية الكافيين.

1. استنساخ (عالي الإنتاجية) من SLCs إلى pHTBV1.1 bacmid

ملاحظة: تستخدم خطوة الاستنساخ بروتوكول استنساخ إعادة التركيب للاستنساخ الفعال والتحويل إلى الإشريكية القولونية (E. coli) باستخدام طريقة الصدمة الحرارية46. تم تصميم البروتوكول للاستنساخ عالي الإنتاجية والموازي لأهداف أو تركيبات متعددة ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع نطاقات أصغر.

  1. في لوحة 96 بئرا ، أضف 150 نانوغرام من استنساخ pDONR221 SLC و 100 نانوغرام من ناقل pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. اجعل حجم التفاعل 8 ميكرولتر مع 10 mM Tris pH 8.0 ، ثم أضف 2 ميكرولتر من مزيج إنزيم إعادة التركيب.
  2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، إضافة 1 ميكرولتر من Proteinase K ، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. استخدم 4 ميكرولتر من خليط التفاعل لتحويل 50 ميكرولتر من خلايا E. coli MACH-1 المختصة كيميائيا باستخدام طريقة الصدمة الحرارية46 ووسط SOC للتعافي. لوحة على LB-agar تحتوي على 5٪ سكروز ، أو أجار SOC ، مكمل ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
  4. حدد المستعمرات التي تؤوي ناقل pHTBV1.1 مع إدخال جين SLC باستخدام البادئات المناسبة (انظر الجدول 1) والبروتوكولات القياسية للمستعمرة PCR47.
  5. تنقية البلازميد المؤتلف من مستعمرات واحدة مع الجين محل الاهتمام باستخدام مجموعة miniprep البلازميد.

2. التبديل

ملاحظة: يتم استخدام الخطوات التالية لنقل جينات SLC من ناقل pHTBV1.1 إلى bacmid لتوليد الفيروس البقعي BacMam في خلايا Sf9. باستخدام طريقة الصدمة الحرارية46 ، يتم تحويل ناقل pHTBV1.1 إلى خلايا E. coli المختصة DH10Bac ، والتي تحتوي على bacmid الأصل مع اندماج lacZ-mini-attTn7. يحدث التحويل بين عناصر ناقل pHTBV1.1 والباكميد الأصلي في وجود بروتينات التحويل التي يوفرها البلازميدالمساعد 48. انظر الجدول 2 للاطلاع على تكوين الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. باستخدام 3 ميكرولتر من 100-200 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي المتجه pHTBV1.1 المنقى ، قم بتحويل DH10Bac باستخدام طريقة الصدمة الحرارية في لوحة PCR ذات 96 بئرا. استعادة الخلايا عن طريق احتضانها في وسط الانتعاش لمدة 4-5 ساعات عند 37 درجة مئوية مع الهز عند 700 دورة في الدقيقة في شاكر التعبير الدقيق.
  2. انشر 50 ميكرولتر من الخلايا المحولة على ألواح اختيار DH10Bac. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة مغطاة بورق الألمنيوم.
  3. اختر مستعمرة بيضاء واحدة (تحتوي على الحمض النووي المؤتلف) وخط للتخفيف. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

3. إنتاج الباكميد عالي الإنتاجية

ملاحظة: يصف البروتوكول خطوات استخراج الباكميدات باستخدام مجموعة تنقية bacmid ذات 96 بئرا.

  1. تلقيح المستعمرات البيضاء الفردية (المعزولة من الألواح المخططة إلى التخفيف) في آبار كتلة بئر عميقة 96 ، تحتوي على 1 مل من 2x LB متوسط (الجدول 2).
  2. يغطى بختم مسامي ويحتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل عند 700 دورة في الدقيقة في شاكر تعبير دقيق.
  3. تحضير مخزون الجلسرين من الخلايا عن طريق خلط 120 ميكرولتر من الثقافة مع 30 ميكرولتر من 60٪ الجلسرين في لوحة عيار دقيق وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  4. أجهزة الطرد المركزي كتلة البئر العميقة عند 2600 × جم لمدة 30 دقيقة. صب المادة الطافية في حاوية مناسبة لإزالة التلوث. اقلب الكتلة واضغط برفق على منشفة ورقية. أضف 250 ميكرولتر من المحلول 1 إلى كل بئر من الكتلة باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  5. إعادة تعليق الكريات; إذا لزم الأمر ، استخدم ماصة متعددة القنوات.
  6. أضف 250 ميكرولتر من المحلول 2 إلى كل بئر وأغلقها بسجادة سيليكون. اقلب بلطف 5x واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. تدور لفترة وجيزة جدا.
  7. أضف 300 ميكرولتر من المحلول 3 وأغلقه بسجادة سيليكون. تخلط بلطف ولكن جيدا عن طريق قلب 5x.
  8. ضع العينة على الثلج لمدة 20 دقيقة ، ثم جهاز الطرد المركزي على حرارة 2600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  9. انقل المادة الطافية الشفافة إلى كتلة جديدة مكونة من 96 بئرا. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 2600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  10. في كتلة جديدة من 96 بئرا عميقا ، قم بتوزيع 0.8 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ لكل بئر. أضف 0.8 مل من المواد الطافية من الآبار المقابلة.
  11. ماصة بلطف صعودا وهبوطا باستخدام ماصة ، ثم احتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل على حرارة 4 درجات مئوية لإنتاج المزيد من البكميد.
  12. جهاز طرد مركزي عند 2600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  13. داخل خزانة السلامة البيولوجية ، قم برش الجزء الخارجي من الكتلة بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وافتح الكتلة ، وتخلص من المادة الطافية.
  14. أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول (v / v) إلى كل بئر واضغط على الكتلة برفق لغسل الحبيبات. قم بتغطيتها بختم بلاستيكي لاصق وأجهزة طرد مركزي عند 2600 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  15. داخل خزانة السلامة البيولوجية ، افتح الكتلة وتخلص من المادة الطافية. اضغط على الكتلة برفق شديد على منشفة ورقية لإزالة الإيثانول. اترك الكتلة تجف إما داخل الغطاء لمدة 1-2 ساعة أو في فرن 50 درجة مئوية.
  16. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE المعقم لإعادة تعليق الحمض النووي bacmid وختمه باستخدام ختم بلاستيكي لاصق. انقل المحتويات إلى لوحة عيار ميكروي ذات قاع V. قم بتخزين الحمض النووي bacmid عند 4 درجات مئوية حتى تكتمل تنقية الاختبار ثم قم بتخزينه في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: على الرغم من عدم قياسه بشكل روتيني ، إلا أنه يمكن توقع عائد يتراوح من 500 إلى 2000 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي الباكميد.
  17. استخدم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسيةللمستعمرة 47 ، وبادئات المتجهات التالية لفحص الباكميدات التي تدمج بنجاح الجين المستهدف:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    ملاحظة: سيكون amplicon أكبر بحوالي 700 bp من الجين المستهدف.

4. النقل

ملاحظة: تستخدم هذه الخطوات لنقل خلايا الحشرات Sf9 مع إنتاج الباكميد ، مما يتسبب في قيام خلايا الحشرات بتوليد جزيئات الفيروس البقعي (P0).

  1. تنمو خلايا Sf9 في وسط حشري خال من المصل بكثافة 2.0-2.4 × 106 خلايا / مل. خفف الخلايا إلى 2 × 105 خلايا / مل في وسط حشري خال من المصل ووزع 1 مل من الخلايا المخففة في بئر زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا. قم بتضمين كاشف نقل فقط بالإضافة إلى عنصر تحكم للخلايا فقط . احتضان اللوحة في حاضنة مرطبة عند 27 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح بربط الخلية.
  2. امزج 38 ميكرولتر لكل بئر من وسط الحشرات الخالي من المصل مع 2 ميكرولتر لكل بئر من كاشف النقل. قم بتوزيع 40 ميكرولتر من الخليط في صفيحة معايرة مسطحة القاع معقمة ذات 96 بئرا. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي bacmid المؤتلف عند 0.5-2.0 ميكروغرام / ميكرولتر ، وقم بتغطية اللوحة ، واحتضانها داخل خزانة السلامة الميكروبيولوجية لمدة 15 دقيقة.
  3. أضف 160 ميكرولتر من وسط الحشرات الخالي من المصل إلى كل بئر من صفيحة المعايرة الدقيقة التي تحتوي على خليط كاشف نقل الحمض النووي.
  4. نضح المتوسطة من الخلايا في الخطوة 4.1. أضيفي برفق 200 ميكرولتر من خليط كاشف نقل الباكيميد المتوسط على الخلايا، وغطي الطبق، واحتضنيه لمدة 4 ساعات في حاضنة مرطبة عند 27 درجة مئوية.
  5. أضف 400 ميكرولتر من وسط الحشرات الخالي من المصل المكمل ب 2٪ FBS إلى كل بئر. لتقليل التبخر ، انقل اللوحة إلى كيس بلاستيكي نظيف ولكن لا تغلقها. احتضان اللوحة عند 27 درجة مئوية لمدة 72 ساعة في حاضنة مرطبة.
  6. بعد 3 أيام ، انقل الوسائط من اللوحة إلى كتلة معقمة من 96 بئرا عميقا وأجهزة طرد مركزي عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل المادة الطافية الموضحة التي تحتوي على الفيروس البقعي P0 إلى كتلة بئر معقمة بعمق 96 وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.

5. تضخيم الفيروس البقعي BacMam

ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية لتضخيم الفيروس البقعي P0 الأولي إلى مخزون فيروسي عيار أعلى ؛ وهي P1 و P2 و P3. عيار P3 النهائي مناسب للتنبيغ والتعبير عن البروتين. من أجل الكفاءة والتوازي ، يستخدم هذا البروتوكول نسبا حجمية ثابتة للتضخيم الفيروسي ، والتي تم تحسينها تجريبيا. ومع ذلك ، إذا لم تظهر الخلايا المحولة لاحقا مضان GFP وزيادة قطر الخلية عن طريق الفحص المجهري أو إذا فشل تعبير البروتين (انظر القسمين 6 و 8) ، فيجب إعادة تحسين تضخيم الفيروس البقعي لتعدد منخفض للعدوى في كل خطوة بعد تحديد عيار الفيروس البقعي49،50،51،52 ، ومراقبة العدوى بواسطة الفحص المجهري الفلوري GFP وزيادة قطر الخلية 53.

  1. قم بإعداد مخزون فيروس P1 عن طريق زراعة خلايا Sf9 في وسط حشري خال من المصل إلى كثافة 2 × 106 خلايا / مل ، وإضافة 2٪ FBS ، وزرع الخلايا في كتلة 24 بئرا عميقة في حجم نهائي قدره 3 مل لكل بئر. أضف 120 ميكرولتر من مخزون فيروس P0 إلى الخلايا.
  2. احتضان الكتلة عند 27 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 450 دورة في الدقيقة في شاكر التعبير الدقيق لمدة 66-72 ساعة. قم بطرد الكتلة عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وحصاد المادة الطافية إلى كتل من 96 بئرا عميقا. يخزن كمخزون فيروس P1 في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
  3. تحضير مخزون فيروس P2 عن طريق إصابة 50 مل من خلايا Sf9 (2 × 106 خلايا / مل كثافة الخلايا) ، نمت في وسط حشري خال من المصل مكمل ب 2٪ FBS ، مع 250 ميكرولتر من مخزون فيروس P1. احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية مع الهز عند 110 دورة في الدقيقة.
  4. حصاد مخزون فيروس P2 بعد 66-72 ساعة عن طريق الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة وتخزينها في 4 درجات مئوية بعيدا عن الضوء.
  5. قم بإعداد مخزون فيروس P3 عن طريق إصابة الحجم المطلوب من خلايا Sf9 (2 × 106 خلايا / كثافة خلية مل) بمخزون فيروسي P2 1: 200 (v / v). احتضان الخلايا عند 27 درجة مئوية مع الهز عند 110 دورة في الدقيقة.
  6. بعد 66-72 ساعة ، أجهزة الطرد المركزي عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة وحصاد فيروس P3 عن طريق جمع المادة الطافية وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.

6. التحويل لاختبار التعبير

ملاحظة: يصف القسم التالي اختبار التعبير على نطاق صغير ويمكن تعديله للاختبار المتوازي للتركيبات المتعددة باستخدام كتل الآبار العميقة.

  1. قم بإعداد محلول بولي إيثيلين جلايكول بنسبة 20٪ (وزن / حجم) عن طريق إذابة 200 جم من PEG 10000 و 12 جم من كلوريد الصوديوم في 600 مل من H2O. يقلب ويصل إلى الحجم النهائي 1000 مل. الأوتوكلاف الحل.
  2. أضف 300 ميكرولتر من فيروس P1 المحصود إلى آبار كتلة 24 بئرا عميقة و 75 ميكرولتر من محلول PEG لكل بئر. احتضن الكتلة في شاكر التعبير الدقيق عند 18 درجة مئوية مع الرج عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وقم بتخزين الكتلة عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  3. هز الكتلة مرة أخرى عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 18 درجة مئوية وطرد مركزي الكتلة عند 3000 × جم لمدة 45 دقيقة. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة في خزانة أمان ميكروبيولوجية.
  4. تحضير خلايا HEK293 المتكيفة مع التعليق في وسط HEK293 بكثافة 2 × 106 خلايا / مل ، والبذور 3 مل في كل بئر تحتوي على حبيبات الفيروس ، مع المكمل ب 5 مللي متر من زبدات الصوديوم.
  5. احتضان الكتلة عند 30 درجة مئوية مع 8٪ CO2 أثناء الاهتزاز عند 200-250 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة.
    ملاحظة: تختلف تركيزات CO2 الموصى بها من قبل البائع أثناء زراعة الخلايا بالنسبة لخطوط خلايا HEK293 المتكيفة مع التعليق والأسلاف ، بنسبة 8٪ و 5٪ على التوالي.
  6. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 900 × غرام لمدة 20 دقيقة وغسل كل بئر مع 1 مل من PBS.
    ملاحظة: نضح 10 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها وعرض الخلايا تحت المجهر الفلوري باستخدام مكعب مرشح متوافق مع GFP لتقييم تعبير البروتين وتوطينه. نضح 10-15 ميكرولتر من الخلايا المعاد تعليقها وقم بتشغيل جل SDS-PAGE كامل الخلية للكشف عن مضان GFP داخلالهلام 54.
  7. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 900 × غرام لمدة 20 دقيقة. قم بتجميد الكريات عند -80 درجة مئوية.

7. تنقية اختبار عالية الإنتاجية على نطاق صغير

ملاحظة: تصف الخطوات التالية سير عمل تنقية اختبار سريع بتنسيق كتلة 24 بئرا لفحص مستويات التعبير من SLCs الفردية. انظر الجدول 2 للاطلاع على تكوين الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل HT إلى كل بئر من الخلايا المحصودة واستمر في صوتنة على الجليد بطول إجمالي قدره 4 دقائق (ركوب الدراجات عند 3 ثوان / 15 ثانية قبالة) في كتل 24 بئرا باستخدام مسبار 24 رأسا.
  2. انقل المحتويات إلى كتلة بئر بعمق 96 ، وأضف 125 ميكرولتر من مخزون المنظفات ، وأغلقها بختم من السيليكون. قم بتدوير الكتلة برفق عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. بدلا من ذلك ، أضف دوديسيل مالتوسيد (DDM) والكوليسترول هيميسوتشينات (CHS) مباشرة إلى الكتل المكونة من 24 بئرا وضعها على شاكر هزاز عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بطرد الكتلة عند 2600 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية إلى كتلة جديدة من 96 بئرا عميقا.
  4. قم بإعداد مخزون بنسبة 50٪ من راتنج Strep-Tactin عالي السعة المتوازن مسبقا مع محلول التحلل.
  5. أضف 100 ميكرولتر من مخزون الراتنج المعاد تعليقه إلى كل بئر.
  6. قم بتغطية الكتلة بختم سيليكون وقم بتدويرها عند 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة ثم قم بطرد مركزي لفترة وجيزة جدا (حتى 200 × جم) لإزالة السائل الملتصق بالغطاء.
  7. ضع لوحة ترشيح 96 بئرا فوق كتلة فارغة وانقل مزيج الراتنج / الطافات إلى لوحة المرشح. اشطف آبار كتلة البئر العميقة ب 800 ميكرولتر من محلول الغسيل HT وانقلها إلى كتلة المرشح لجمع أكبر قدر ممكن من الراتنج.
  8. اسمح للمخزن المؤقت بالتنقيط أو جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 200 × جم وجمع التدفق. ضع لوحة المرشح فوق كتلة غسيل جديدة واغسل الراتنج ب 800 ميكرولتر من محلول الغسيل HT ، مما يسمح للمخزن المؤقت بالتنقيط (أو جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة). كرر خطوة الغسيل مرتين أخريين وقم بالطرد المركزي للكتلة عند 500 × جم لمدة 3 دقائق لإزالة المخزن المؤقت المتبقي للغسيل HT.
  9. ضع لوحة المرشح فوق لوحة عيار 96 بئرا. أضف 50 ميكرولتر من محلول شطف HT واحتضانه بالرج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. عينات Elute عن طريق الطرد المركزي في 500 × غرام لمدة 3 دقائق.
  10. قم بتشغيل 15 ميكرولتر من العينة المستخلصة على جل SDS-PAGE مصبوغ ب Coomassie للتحقق من تعبير البروتين. قم بتحميل العينات المتبقية من eluent على نظام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم للكشف عن التألق (FSEC) لتقييم التشتت الأحادي للبروتين في DDM / CHS.

8. النقل للتعبير على نطاق واسع

ملاحظة: الخطوات التالية هي بروتوكول RESOLUTE القياسي لتعبير SLC. ستتطلب الأهداف الفردية مزيدا من التحسين لوقت التعبير ودرجة حرارة الحضانة وتركيز زبدات الصوديوم. علاوة على ذلك ، نقوم بشكل روتيني بتحسين تعدد عدوى الفيروس البقعي عن طريق اختبار نسب حجمية مختلفة لفيروس P3 المستخدم لإصابة خلايا HEK293 المتكيفة مع التعليق في تجارب صغيرة النطاق. هذا فعال من حيث الوقت ، ويستخدم التقنيات والمعدات الموجودة بالفعل ، ويقيم بشكل مباشر الناتج التجريبي المطلوب. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة التجريبية إعادة التحسين مع كل تضخيم لفيروس P3 ، وتتوفر طرق أخرى لتحديد جزيئات الفيروس البقعي49،50،51،52.

  1. قم بزيادة الحجم المطلوب من خلايا HEK293 المتكيفة مع التعليق في وسط HEK293.
  2. تمييع خلايا HEK293 المتكيفة مع التعليق إلى 1 × 106 خلايا / مل وتنمو لمدة 24 ساعة (عند 170 دورة في الدقيقة لزجاجات الأسطوانة سعة 2 لتر و 105 دورة في الدقيقة لزجاجات الأسطوانة سعة 3 لتر).
  3. أضف 30 مل من فيروس P3 لكل لتر من الخلايا وأضف 5 مللي مول من زبدات الصوديوم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة أو عند 30 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  4. أثناء فترة الحضانة وبعدها ، تتمثل الخطوة الرئيسية في فحص الخلايا باستخدام الفحص المجهري برايت فيلد للتحقق من التلوث الميكروبي وصلاحية الخلية. قم بتقييم تعبير البروتين وتوطينه باستخدام المجهر الفلوري باستخدام مكعب مرشح متوافق مع GFP.
  5. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 900 × غرام لمدة 20 دقيقة.
  6. اغسل حبيبات الخلية عن طريق تعليقها في 10-15 مل من PBS لكل لتر من زراعة الخلايا والحبيبات مرة أخرى عند 900 × جم لمدة 20 دقيقة.
  7. قم بتجميد كريات الخلية في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.

9. تنقية البروتين

ملاحظة: فيما يلي طريقة RESOLUTE القياسية لتنقية SLC ل 5 لتر من زراعة الخلايا. لكل هدف SLC ، يجب تحديد المنظف الأمثل تجريبيا. قم بإعداد المخزن المؤقت الأساسي ، ومحلول مخزون المنظفات ، والغسيل ، والشطف ، ومخازن SEC مسبقا (الجدول 2). للحصول على قائمة بالمنظفات القياسية التي تم اختبارها، انظر الجدول 3. يقلل ATP و MgCl2 في المخزن المؤقت للغسيل من التلوث ببروتينات الصدمة الحرارية.

  1. اليوم 1
    1. قم بإذابة حبيبات الخلايا المجمدة في حمام مائي مضبوط على درجة حرارة الغرفة.
    2. تحضير محلول الذوبان مع 135 مل من المخزن المؤقت الأساسي وثلاثة أقراص كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني. السماح للأقراص أن تذوب.
    3. أعد تعليق الحبيبات المذابة بمحلول الذوبان. استخدم 27 مل من محلول الذوبان لكل 10-15 جم من حبيبات الخلية ، وأضف DNase ، واسكبه في خالط Dounce المثلج. قم بتجانس المحلول عن طريق تحريك المكبس لأعلى ولأسفل بمقدار 20 ضعفا تقريبا ، مع إبقاء الخالط على الجليد.
      ملاحظة: يجب تحسين حجم إعادة التعليق بناء على البروتين المستهدف وكتلة حبيبات الخلية ، والتي ستختلف بسبب كثافة الخلية عند الحصاد. يمكن إضافة DNase التجاري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن أيضا التعبير عن DNase وتنقيته داخليا باستخدام البروتوكولات المعمول بها55.
    4. أضف محلول مرق المنظفات إلى التركيز النهائي 1٪.
      ملاحظة: تتمثل الخطوة الرئيسية لتحسين تنقية البروتين في تحديد المنظف الأمثل لإذابة وتنقية SLC ، والتي يجب تحديدها تجريبيا. لقد استخدمنا بانتظام المنظفات المختلفة. كل منها بمفرده وبالاشتراك مع كوليستيريل هيميسوكسينات ، مع الحفاظ على نسبة كتلة المنظف إلى CHS عند 10: 1.
    5. انقل خليط الذوبان إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل. قم بالتدوير ببطء لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    6. جهاز طرد مركزي الحل عند 50000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جمع طاف .
    7. قم بموازنة حجم السرير 4-6 مل من راتنج Strep-Tactin مع المخزن المؤقت الأساسي.
    8. أضف راتنجا متوازنا إلى المادة الطافية القابلة للذوبان وقم بتدويرها لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    9. صب المحلول في عمود تدفق الجاذبية واترك المحلول يتدفق خلاله.
    10. اغسل الراتنج ب 30 ضعف حجم سرير المخزن المؤقت للغسيل Strep في 3 خطوات متساوية الحجم.
    11. أضف 3-5 مل من محلول الشطف ، واحتضن لمدة 15 دقيقة ، واجمع الشحم. كرر هذه الخطوة أربع مرات أخرى ، مع جمع كل كسر شطف على حدة.
      ملاحظة: الخطوة الرئيسية هي شطف البروتين من راتنج Strep-Tactin ، حيث من المهم احتضانه لمدة 15 دقيقة بعد كل إضافة لمحلول الشطف. عادة ، يحتوي جزء الشطف الأول على تركيز أقل من البروتين بسبب تخفيف المخزن المؤقت للشطف بواسطة المخزن المؤقت للغسيل المتبقي. لذلك ، يمكن التخلص من جزء الشطف الأول إذا كان التركيز النهائي للبروتين أعلى مطلوبا. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا تحليل تركيز البروتين في جميع الاستخلاص التسلسلي باستخدام SDS-PAGE لتحسين البروتوكول.
    12. قم بقياس تركيز البروتين بواسطة التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، والجمع بين كسور الشطف المطلوبة ، وإضافة البروتياز 3C بنسبة 1: 5 (وزن / وزن) إلى 1:10 (وزن / وزن).
    13. قم بالتدوير ببطء طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الخطوتان 9.1.12 و9.1.13 ضروريتان فقط إذا كانت علامة GFP بحاجة إلى الإزالة. إذا لم تكن إزالة العلامة مطلوبة، فانتقل إلى الخطوة 9.2.4 مباشرة. بدلا من ذلك ، يمكن الاحتفاظ بالبروتين عند 4 درجات مئوية طوال الليل للاستمرار في اليوم التالي. علاوة على ذلك ، بالنسبة ل SLCs ذات الاستقرار المتناقص ، قد يحتاج تركيز البروتياز وفترة الحضانة ودرجة الحرارة إلى التحسين. ينشط البروتياز 3C على نطاق واسع من درجات الحرارة ويسمح بالتحسين الأنسب لمختلف SLCs.
  2. اليوم 2
    1. موازنة 2-4 مل من حجم السرير من راتنج تقارب معدن الكوبالت مع العازلة SEC.
    2. أضف راتنج تقارب معدن الكوبالت المتوازن إلى خليط تفاعل 3C طوال الليل وقم بتدويره لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. صب المحلول في عمود تدفق الجاذبية واجمع التدفق.
    4. ركز التدفق في مرشح طرد مركزي مقطوع 100 كيلو دالتون عن طريق الدوران عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية واخلط العينة برفق كل 5 دقائق حتى يتم الوصول إلى حجم حقن SEC المطلوب.
    5. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم القائم على ديكستران أغاروز باستخدام المخزن المؤقت SEC. يجب تنفيذ إجراء SEC عند 4 درجات مئوية (غرفة تبريد أو غرفة باردة).
      ملاحظة: الخطوة الرئيسية: اعتمادا على حالة oligomeric من SLC ، يمكن استخدام عمود مختلف ، مثل عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم القائم على الأغاروز ، لأداء SEC.
    6. قم بحقن العينة في حلقة العينة وقم بتشغيل برنامج SEC ، بمعدل تدفق بحيث يكون ضغط العمود أقل من مواصفات الشركة المصنعة للعمود. باستخدام جامع الكسور ، اجمع تلقائيا 0.3 مل من الكسور على مدار تشغيل SEC بالكامل.
    7. تجمع كسور الذروة ، وقياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ، والتركيز في مكثف طرد مركزي مقطوع 100 كيلو دالتون إلى الحجم / التركيز المطلوب عن طريق الدوران عند 3000 × جم عند 4 درجات مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يمكن استنساخ جينات SLC من بلازميدات pDONR الحازمة إلى ناقلات BacMam للتعبير عن الثدييات
أثبتت البروتوكولات الموصوفة للاستنساخ والتعبير والتنقية نجاحها للعديد من ناقلات SLC عبر طيات البروتين المتعددة. ومع ذلك ، تشمل الإجراءات العديد من نقاط التفتيش لرصد التقدم ، مما يسمح بالتحسين لمرا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وظل تطوير العلاجات التي تستهدف SLC معوقا بسبب عدم وجود توصيف منهجي لوظيفة الناقل. وقد أدى ذلك إلى انخفاض عدد الأدوية التي تستهدف هذه الفئة من البروتين بشكل غير متناسب بالنسبة إلى GPCRs والقنوات الأيونية63 ، على الرغم من أدوارها العديدة في العمليات الطبيعية والفيزيولوجية المرضية. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم تنفيذ هذا العمل في إطار مشروع RESOLUTE. تلقت RESOLUTE تمويلا من التعهد المشترك لمبادرة الأدوية المبتكرة 2 بموجب اتفاقية المنحة رقم 777372. يتلقى هذا المشروع المشترك دعما من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي و EFPIA. تعكس هذه المقالة آراء المؤلفين فقط ولا تتحمل IMI ولا الاتحاد الأوروبي و EFPIA المسؤولية عن أي استخدام قد يتم للمعلومات الواردة فيها. تم توفير بلازميد pHTBV من قبل البروفيسور فريدريك بويس (هارفارد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3C proteaseProduced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentratorsSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96-well bacmid purification kitMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)Greiner Bio-One780271
Adhesive plastic sealsQiagen19570Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography columnCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduced in-house
BisTrisSigma AldrichB9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris saltAnatraceCH210CHS
Cobalt metal affinity resinTakara Bio635653TALON Metal Affinity Resin
D(+)-BiotinSigma Aldrich851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography columnCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)DWK Life Sciences357546
EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma Aldrich4693132001cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycerolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgeninAnatraceGDN101GDN
Gravity flow columnsCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 mediumThermo Fisher12338018FreeStyle 293 medium
HEPESApollo ScientificBI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC columnSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Insect transfection reagentSigma Aldrich71259Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Magnesium Chloride HexahydrateSigma AldrichM2670
Micro-expression shakerGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-β-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-β-D-GlucopyranosideAnatraceN324SNG
n-Octyl-d17-β-D-GlucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl EtherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl EtherAnatraceAPO129C12E9
Porous seal for tissue culture platesVWR60941-084Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase KNew England BiolabsP8107S
Recombination enzyme mixThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Serum-free insect mediaGibco10902088Sf-900 II serum-free media
Sodium ButyrateSigma Aldrich303410
Sonicator 24-head probeSonics630-0579
Sonicator power unitSonicsVCX 750
Strep-Tactin resinIBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
SucroseSigma AldrichS7903
Sucrose MonododecanoateAnatraceS350DDS
Suspension-adapted HEK293 cellsThermo FisherA14527Expi293F
Transfection reagentSigma Aldrich70967GeneJuice Transfection Reagent

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969(2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134(2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751(2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350(2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814(2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533(2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357(2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82(2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821(2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253(2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817(2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714(2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685(2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317(2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved