الكشف عن وقياس الدهون الأحادية والدهون الثنائية التي تنتجها الزائفة الزنجارية

Summary

تنتج الزائفة الزنجارية المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي للرامنوليبيد. يكتشف كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ويحدد نسبة الدهون الأحادية والثنائية التي تنتجها كل سلالة. يتضمن القياس الكمي لإجمالي الرامنوليبيدات تقييم مكافئات الرامنوز الموجودة في هذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من المواد الطافية المستزرعة باستخدام طريقة الأورسينول.

Abstract

البكتيريا البيئية Pseudomonas aeruginosa هي مسببات الأمراض الانتهازية مع مقاومة عالية للمضادات الحيوية التي تمثل خطرا على الصحة. تنتج هذه البكتيريا مستويات عالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المعروفة باسم rhamnolipids (RL) ، وهي جزيئات ذات قيمة تقنية حيوية كبيرة ولكنها مرتبطة أيضا بسمات الفوعة. وفي هذا الصدد، قد يكون الكشف عن الرخصة وتحديدها كميا مفيدا لكل من تطبيقات التكنولوجيا الأحيائية ومشاريع البحوث الطبية الحيوية. في هذه المقالة ، نوضح خطوة بخطوة تقنية الكشف عن إنتاج شكلين من RL التي تنتجها P. aeruginosa باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC): أحادي الرامنوليبيد (mRL) ، والجزيئات المكونة من ديمر من الأحماض الدهنية (بشكل رئيسي C10-C10) مرتبطة بجزء واحد من rhamnose ، و di-rhamnolipids (dRL) ، وهي جزيئات تتكون من ثنائي حمض دهني مماثل مرتبط بشقين من rhamnose. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم طريقة لقياس الكمية الإجمالية ل RL بناء على التحلل المائي الحمضي لهذه المواد الخافضة للتوتر السطحي الحيوي المستخرجة من طاف ثقافة P. aeruginosa والكشف اللاحق عن تركيز الرامنوز الذي يتفاعل مع الأورسينول. يمكن استخدام الجمع بين كلتا التقنيتين لتقدير التركيز التقريبي ل mRL و dRL الناتج عن سلالة معينة ، كما هو موضح هنا مع سلالات النوع PAO1 (مجموعة الفيلوغروب 1) و PA14 (مجموعة الفيلو 2) و PA7 (مجموعة الفيلو 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa هي بكتيريا بيئية وممرض انتهازي يثير قلقا كبيرا بسبب إنتاجها للسمات المرتبطة بالفوعة ومقاومتها العالية^{للمضادات} الحيوية ^1,2. المستقلب الثانوي المميز الذي تنتجه هذه البكتيريا هو RL الفاعل بالسطح الحيوي ، والذي يتم إنتاجه بطريقة منسقة مع العديد من السمات المرتبطة بالفوعة مثل فينازين بيوسيانين ، وهو مضاد حيوي له نشاط الأكسدة والاختزال ، والإيلاستاز البروتياز³. تم استغلال خصائص الشد النشط والاستحلاب ل RL في تطبيقات صناعية مختلفة ويتم تسويقها حاليا⁴.

تنتج معظم سلالات P. aeruginosa....

Protocol

تم تخطيط هذا الإجراء في الشكل التكميلي 1. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. الكشف عن mRL و dRL في طافات ثقافة P. aeruginosa باستخدام TLC

1. ابدأ بمرق الطرد المركزي لسلالة P. aeruginosa ذات الأهمية ، المزروعة في وسط سائل لمدة 24 ساعة (للوصول إلى المرحلة الثابتة من النمو حيث يتم إنتاج RL). عادة ، تحتوي هذه الثقافات على 1 × 10⁹ بكتيريا لكل مل.
2. اضبط الرقم الهيدروجيني للثقافة على 2 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز.
3. ضع 5 مل من طاف الثقافة المحمض في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل و....

النتائج

في هذه المقالة ، تم استخدام ثلاث سلالات مختلفة من نوع P. aeruginosa لتمثيل ثلاث مجموعات فيلو ، لكل منها مستويات إنتاج RL مختلفة ونسب mRL و dRL. تشمل هذه السلالات PAO1 (عزل الجرح من أستراليا ، 1955²²) ، PA14 (عزل نباتي من الولايات المتحدة الأمريكية ، 1977²³) ، و PA7 (عزل سريري من الأرجنتين ،.......

Discussion

الطريقة الأكثر دقة للكشف عن RL وقياسه هي HPLC إلى جانب قياس الطيف الكتلي (MS)^7،8،27 ؛ ومع ذلك ، فإنه يتطلب معدات متخصصة ومكلفة قد لا تكون في متناول العديد من الباحثين. يمكن إجراء الطرق الموصوفة هنا بشكل روتيني باستخدام المواد والمعدات المختبرية .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C