تسجيلات مزدوجة خارج الخلية في الحصين الفأر وقشرة الفص الجبهي

Summary

يحدد هذا البروتوكول استخدام جهاز تسجيل وأقطاب كهربائية مصممة خصيصا لتسجيل إمكانات المجال المحلي والتحقيق في تدفق المعلومات في قرن آمون الفأر وقشرة الفص الجبهي.

Abstract

تقنية تسجيل إمكانات المجال المحلي (LFPs) هي طريقة فيزيولوجية كهربية تستخدم لقياس النشاط الكهربائي لمجموعات الخلايا العصبية الموضعية. إنه بمثابة أداة حاسمة في البحث المعرفي ، لا سيما في مناطق الدماغ مثل الحصين وقشرة الفص الجبهي. وتكتسي تسجيلات LFP المزدوجة بين هذه المناطق أهمية خاصة لأنها تسمح باستكشاف اتصالات الإشارات الأقاليمية. ومع ذلك ، نادرا ما يتم وصف طرق إجراء هذه التسجيلات ، ومعظم أجهزة التسجيل التجارية إما باهظة الثمن أو تفتقر إلى القدرة على التكيف لاستيعاب تصميمات تجريبية محددة. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا شاملا لإجراء تسجيلات LFP ثنائية القطب في قرن آمون الفأر وقشرة الفص الجبهي للتحقيق في آثار الأدوية المضادة للذهان ومعدلات قناة البوتاسيوم على خصائص LFP في هذه المناطق. تتيح هذه التقنية قياس خصائص LFP ، بما في ذلك أطياف الطاقة داخل كل منطقة دماغية والتماسك بين الاثنين. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير جهاز تسجيل منخفض التكلفة ومصمم خصيصا لهذه التجارب. باختصار ، يوفر هذا البروتوكول وسيلة لتسجيل الإشارات ذات نسب الإشارة إلى الضوضاء العالية في مناطق مختلفة من الدماغ ، مما يسهل التحقيق في اتصالات المعلومات بين الأقاليم داخل الدماغ.

Introduction

تشير إمكانات المجال المحلي (LFPs) إلى النشاط الكهربائي المسجل من الفضاء خارج الخلية ، مما يعكس النشاط الجماعي لمجموعة موضعية من الخلايا العصبية. وهي تظهر مجموعة متنوعة من الترددات ، تمتد من الموجات البطيئة عند 1 هرتز إلى التذبذبات السريعة عند 100 هرتز أو 200 هرتز. ارتبطت نطاقات تردد محددة بالوظائف المعرفية مثل التعلم والذاكرة واتخاذ القرار ^1,2. تم استخدام التغييرات في خصائص LFP كمؤشرات حيوية لمختلف الاضطرابات العصبية ، بما في ذلك الخرف والفصام^3،4. يمكن أن يقدم تحليل تسجيلات LFP رؤى قيمة حول الآليات المرضية الأساسية المرتبطة بهذه الحالات والاستراتيجيات العلاجية المحتملة.

تسجيل LFP المزدوج هو تقنية تستخدم لقياس النشاط الكهربائي الموضعي داخل وبين منطقتين محددتين من الدماغ. توفر هذه التقنية فرصة ثمينة للتحقيق في الديناميات العصبية المعقدة واتصالات الإشارات التي تحدث داخل وبين مناطق الدماغ المتميزة. كشفت الدراسات السابقة أن اكتشاف التغيرات في الخصائص العصبية لمناطق الدماغ الفردية يمكن أن يكون معقدا ، ولكن يمكن ملاحظة التغيرات في التواصل القشري بين الأقاليم ^5,6. لذلك ، يوفر استخدام تسجيل LFP المزدوج وسيلة قوية لمعالجة هذه المشكلة.

يلعب اتصال الحصين والفص الجبهي دورا حاسما في تعديل الوظائف المعرفية ، وقد تم ربط الخلل الوظيفي باضطرابات عصبية مختلفة ^7,8. يمكن أن توفر تسجيلات الأقطاب الكهربائية المزدوجة لهذه المناطق معلومات حول هذه التفاعلات. لسوء الحظ ، هناك معلومات محدودة متاحة حول طرق إجراء تسجيلات LFP ذات القطب المزدوج بين هذه المناطق. علاوة على ذلك ، فإن أجهزة التسجيل المتاحة تجاريا باهظة الثمن بشكل عام وتفتقر إلى القدرة على التكيف مع تصميمات تجريبية محددة. تتضمن الطريقة التقليدية لتسجيل LFPs استخدام كابل محمي لتوصيل جهاز التسجيل بأقطاب كهربائية مزروعة في دماغ. ومع ذلك ، فإن هذا النهج عرضة لآثار الحركة والضوضاء البيئية ، مما يؤثر على جودة وموثوقية الإشارات المسجلة.

يصف هذا البروتوكول إجراء شاملا لإجراء تسجيلات LFP ثنائية القطب في قرن آمون الفأر وقشرة الفص الجبهي ، باستخدام مقدمة منخفضة التكلفة مصممة خصيصا يمكن وضعها على رأس. تمكن هذه الطرق الباحثين من التحقيق في أنماط التذبذب الخاصة بالمنطقة داخل منطقتين دماغيتين منفصلتين واستكشاف تبادل المعلومات بين الأقاليم والاتصال بين هذه المناطق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة فلوري لأخلاقيات (جامعة ملبورن ، رقم 22-025UM) وفقا للقانون الأسترالي لرعاية واستخدام للأغراض العلمية. تم استخدام C57BL / 6 ذكور الفئران (8 أسابيع) ، التي تم الحصول عليها من مركز الموارد الحيوانية (أستراليا) ، في هذه الدراسة.

1. تصميم وتصنيع الكواليس

ملاحظة: لوحة PCB الأمامية عبارة عن لوحة مدمجة رباعية الطبقات مقاس 14 مم × 12 مم مصممة لتوضع مباشرة على رأس. يستخدم شريحة مكبر صوت تجارية (انظر جدول المواد) ، وجميع ملفات التصميم و Gerber متاحة عبر الإنترنت (رابط GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. تقديم المواصفات التالية للشركة المصنعة: سمك اللوح: 0.6 مم ؛ الحد الأدنى للتتبع / التباعد: 4 مل ؛ الحد الأدنى لحجم الثقب: 0.2 مم.
2. أثناء عملية تجميع ثنائي الفينيل متعدد الكلور ، اتبع هذا الترتيب:
   1. قم بلحام شريحة مكبر الصوت على اللوحة باستخدام مسدس الهواء الساخن المحدد على 350 درجة مئوية.
   2. لحام المكونات السلبية.
   3. قم بلحام موصل SPI وموصل القطب (انظر جدول المواد).
3. افحص اللحام تحت المجهر لضمان الجودة. ثبت موصل SPI في مكانه باستخدام الإيبوكسي لمزيد من الثبات.
4. استخدم برنامج تسجيل تابع لجهة خارجية ولوحة تحكم (انظر جدول المواد) للحصول على الإشارة. راجع دليل مستخدم البرنامج للحصول على إرشادات مفصلة.
5. تدعم مرحلة الرأس المصممة 8 قنوات. في البرنامج ، قم بتمكين القنوات 8 و 9 و 12 و 13 و 20 و 21 و 22 و 23 للتسجيل.

2. تصنيع القطب

1. قطع أسلاك التنغستن المطلية ب PFA (انظر جدول المواد) إلى أطوال محددة لأنواع الأقطاب المختلفة: قطب قشرة الفص الجبهي (12 مم) ، قطب الحصين (10 مم) ، والقطب الأرضي (6 مم).
2. قطع الأنبوب النحاسي (انظر جدول المواد) إلى شرائح 3 مم.
3. قم بإزالة 2 مم من الطلاء في نهاية كل سلك باستخدام أخف وزنا ، ثم قم بلحام سلك القطب بإحكام بالأنبوب النحاسي. يبلغ قطر الأنبوب النحاسي 0.45 مم وقطره الخارجي 0.60 مم.
4. بالنسبة للقطب الأرضي ، قم بلحام برغي من الفولاذ المقاوم للصدأ M1.2 (انظر جدول المواد) بالقطب. ضع التدفق القائم على حمض الفوسفوريك على المسمار لتعزيز اللحام. بعد اللحام ، قم بتنظيف المسمار باستخدام الكحول.
   ملاحظة: ارتد قفازات للحماية أثناء عملية اللحام.

3. الإجراء الجراحي

1. تخدير الفأر في غرفة التخدير مع 3٪ إيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين.
2. ضع الماوس المخدر على وسادة تدفئة وقم بتثبيته في إطار مجسم (انظر جدول المواد).
3. ضبط معدل صيانة الأيزوفلوران إلى 2.5-3٪ وتقليل تدفق الأكسجين إلى 500 مل / دقيقة. باستخدام قرصة إصبع القدم ، تحقق مما إذا كان لا يزال تحت التخدير العميق.
4. حقن كاربروفين تحت الجلد بمعدل 0.5 ملغ/كغ وتطبيق مرهم العين لحماية العين.
5. حلق وتعقيم رأس الفأر باستخدام البوفيدون اليود و 80 ٪ من الإيثانول.
6. قم بعمل شق 8 مم على طول خط الوسط لفروة الرأس ، وإزالة النسيج الضام في منطقة الشق.
7. ضع بيروكسيد الهيدروجين لتنظيف سطح الجمجمة ، مع الحرص على عدم لمس الجلد المحيط.
8. قم بمحاذاة معالم bregma و lambda إلى نفس المستوى لوضع القطب بدقة (bregma و lambda هما المكان الذي يتقاطع فيه الخيط السهمي مع الغرز الإكليلية و lambdoid ).
9. ثقوب للقطب الكهربي المرجعي/الأرضي، ومسامير التثبيت (نتوء الحفر 0.9 مم)، والأقطاب الكهربائية النشطة (نتوءات الحفر 0.3 مم) عند الإحداثيات المحددة.
10. قم بتوصيل القطب الكهربائي المصنوع خصيصا (الخطوة 2) بذراع الإطار التجسيمي وتأكد من أنه عمودي على الدماغ.
11. زرع القطب في منطقة الحصين CA1 (AP - 1.8 مم ، ML - 1.3 مم ، DV - 1.4 مم).
    ملاحظة: AP ، الأمامي الخلفي ؛ ML ، متوسط الجانب. DV ، الظهرية البطنية.
12. كرر زرع القطب في قشرة الفص الجبهي (AP - 2.0 مم ، ML - 0.3 مم ، DV - 1.7 مم).
13. قم بتأمين الأقطاب الكهربائية باستخدام مادة لاصقة قوية وأسمنت أسنان قوي متوفر تجاريا (انظر جدول المواد).
14. قم بزرع اثنين من مسامير التثبيت مقاس 1.2 مم (AP - 1.8 مم ، ML -1.6 مم) لمنع الحركة.
15. ضع القطب المرجعي / الأرضي على اتصال مباشر مع الأم الجافية ، 2 مم خلفي و 2 مم أحادي الجانب لمعلم لامدا.
16. قم بتوصيل جانب الأنبوب النحاسي للأقطاب الكهربائية بموصل مقبس متعدد القنوات (انظر جدول المواد) مع وجود القطب الأرضي في المنتصف.
17. استخدم أنابيب الانكماش الحراري 0.8 مم على السطح الخارجي للدبوس الأوسط للعزل.
18. قم بتأمين الأقطاب الكهربائية ومسامير التثبيت والموصل بمادة لاصقة وأسمنت أسنان.

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. لتخفيف آلام ما بعد الجراحة ، يتم حقن كاربروفين بجرعة 5-10 مجم / كجم تحت الجلد كل 12-24 ساعة بناء على تقييم الألم لمدة ثلاثة أيام.
2. تزويد بفترة نقاهة لمدة أسبوع قبل البدء في أي تسجيل أو إجراءات تجريبية.

5. إجراء التسجيل

1. تعامل مع لمدة 15 دقيقة ، مرتين يوميا ، لمدة ثلاثة أيام متتالية.
2. التقط الفئران عن طريق إغلاق اليد حولها برفق دون الضغط المفرط.
3. ضع لوح الكواليس على رأس لمدة 30 دقيقة مرة واحدة يوميا لمدة ثلاثة أيام متتالية.
4. في يوم التسجيل ، تأقلم مع غرفة التسجيل لمدة 30 دقيقة.
5. ضع في غرفة تسجيل صغيرة داخل قفص فاراداي لتقليل التداخل الكهربائي الخارجي. قم بتوصيل المسرح المخصص للتسجيل.
6. افتح برنامج التسجيل وحدد معدل أخذ عينات 2.00 كيلو هرتز. قم بتعطيل جميع القنوات باستثناء 13 و 20 عن طريق تحديد كل قناة والضغط على شريط المسافة.
7. في نافذة النطاق الترددي للأجهزة ، اضبط النطاق الترددي السفلي على 2 هرتز وعرض النطاق الترددي العلوي على 100 هرتز.
8. في نافذة تصفية البرامج ، اضبط مرشح الترددات المنخفضة على 100 هرتز ومرشح الترددات العالية على 2 هرتز.
9. اختر مسار التخزين بالنقر فوق تحديد اسم الملف ، ثم انقر فوق تسجيل.
10. ابدأ كل جلسة تسجيل بفترة تعود مدتها 10 دقائق متبوعة بتسجيل تخطيط كهربية الدماغ الأساسي لمدة 15 دقيقة.
11. بعد التسجيل الأساسي، يتم تطبيق الدواء عن طريق الحقن داخل الصفاق والاستمرار في التسجيل لمدة 30 دقيقة إضافية دون تأخير.
    ملاحظة: راجع قسم النتائج للحصول على تفاصيل حول الأدوية المستخدمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

توضح النتائج الموضحة هنا تأثيرات العديد من الأدوية على خصائص إمكانات المجال المحلي (LFPs) التي تم اختبارها في أربع مجموعات من الفئران الذكور C57BL / 6 (ن = 8 لكل مجموعة ؛ العمر: 8 أسابيع ؛ الوزن: 24.0 ± 0.42 جم). تضمنت الأدوية التي تم اختبارها عقار كلوزابين المضاد للذهان ، ومعدلات قناة البوتاسيوم 4-أمينو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يحدد البروتوكول المقدم هنا إجراءات بناء مرحلة رئيسية مخصصة مصممة خصيصا للتسجيل المتزامن لإمكانات المجال المحلي المزدوج (LFPs) في الحصين (HIP) وقشرة الفص الجبهي (PFC). توفر الخطوات التفصيلية الواردة في هذا البروتوكول معلومات كافية للباحثين لفحص اتصالات الإشارة بدقة داخل كل منطقة وبين HIP و PFC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast