استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر

Summary

التصوير الحي خارج الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة العمليات الديناميكية للحركات الخلوية والتفاعلات في الأنسجة الحية. هنا ، نقدم بروتوكولا ينفذ الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتتبع الخلايا الظهارية السنية الحية في قواطع الفئران البالغة المستزرعة.

Abstract

تظهر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار كنظام نموذجي قابل للتتبع للغاية للتحقيق في تنظيم الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة البالغة وتجديد الأسنان. تنقسم هذه المجموعات السلفية وتتحرك وتتمايز بنشاط للحفاظ على توازن الأنسجة وتجديد الخلايا المفقودة بطريقة سريعة الاستجابة. ومع ذلك ، فإن التحليلات التقليدية باستخدام أقسام الأنسجة الثابتة لا يمكن أن تلتقط العمليات الديناميكية للحركات والتفاعلات الخلوية ، مما يحد من قدرتنا على دراسة لوائحها. تصف هذه الورقة بروتوكولا للحفاظ على قواطع الفئران الكاملة في نظام زراعة النباتات والخلايا الظهارية السنية الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. تضيف هذه التقنية إلى مجموعة أدواتنا الحالية لأبحاث الأسنان وتسمح للمحققين بالحصول على معلومات زمانية مكانية حول سلوكيات الخلايا ومنظماتها في الأنسجة الحية. نتوقع أن تساعد هذه المنهجية الباحثين على استكشاف الآليات التي تتحكم في العمليات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء تجديد الأسنان وتجديدها.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين ، برزت قاطعة الماوس كمنصة لا تقدر بثمن للتحقيق في مبادئ تنظيم الخلايا الجذعية البالغة وتجديد الأسنان ^1,2. تنمو قاطعة الفأر باستمرار وتجدد نفسها طوال حياة. يقوم بذلك عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة ، والتي يمكن أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا السن ^1,2. في حين أن الخلايا الجذعية الظهارية السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية ، التي تفرز مصفوفة المينا ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات السنية ، والأرومات الأسمنتية ، والخلايا الليفية ، والتي تشكل العاج ، والملاط....

Protocol

تم الحفاظ على جميع الفئران في مرافق حيوانية خالية من مسببات الأمراض في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (UCLA) أو الجامعة العبرية في القدس (HUJI). تم إجراء جميع التجارب التي شملت الفئران وفقا للوائح والبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية المعنية لرعاية واستخدام (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) أو (MD-23-17184-3; هوجي). يظهر سير العمل العام للخطوات التجريبية في الشكل 2 أ. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع الأدوات والكواشف والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد الحلول والمواد الهلامية

1. وسط التشريح: قم بإعداد DMEM / F12 الطازج مع 0.5٪ جلوكوز واحت....

النتائج

يتم تغليف المنطقة القمية لقواطع الفأر البالغة داخل الفك السفلي (الشكل 1) ، وبالتالي ، لا يمكن الوصول إليها مباشرة لتصور الخلايا السلفية المقيمة داخل منطقة النمو وتتبعها مباشرة. لذلك ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج القاطعة بأكملها من عظم الفك والحفاظ عليها في نظام استزراع نبا?.......

Discussion

يعد تصوير الأنسجة الحية تقنية مهمة تسمح لنا بدراسة العمليات والسلوكيات الديناميكية للخلايا عند الحفاظ عليها في بيئتها المتخصصة⁴¹. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التصوير في الجسم الحي لأع.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09