تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

Summary

يمكن أن يؤدي تطبيق طبقات الدعم على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) إلى زيادة كثافة الجسيمات ، والحد من التفاعلات مع واجهة الهواء والماء ، وتقليل الحركة التي يسببها الحزمة ، وتحسين توزيع اتجاهات الجسيمات. تصف هذه الورقة بروتوكولا قويا لطلاء شبكات cryoEM بطبقة أحادية من الجرافين لتحسين تحضير عينة التبريد.

Abstract

في المجهر الإلكتروني المبرد (cryoEM) ، يتم تطبيق الجزيئات الكبيرة المنقاة على شبكة تحمل رقائق كربون هولي. ثم يتم تنظيف الجزيئات لإزالة السائل الزائد وتجميدها بسرعة في طبقة سميكة من الجليد الزجاجي بسمك 20-100 نانومتر تقريبا ، معلقة عبر ثقوب رقائق بعرض 1 ميكرومتر تقريبا. يتم تصوير العينة الناتجة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد ، وبعد معالجة الصور باستخدام برنامج مناسب ، يمكن تحديد هياكل الدقة شبه الذرية. على الرغم من اعتماد cryoEM على نطاق واسع ، لا يزال تحضير العينات يمثل عنق زجاجة شديد في سير عمل cryoEM ، حيث يواجه المستخدمون غالبا تحديات تتعلق بالعينات التي تتصرف بشكل سيئ في الجليد الزجاجي المعلق. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق لتعديل شبكات cryoEM بطبقة واحدة مستمرة من الجرافين ، والتي تعمل كسطح دعم يزيد غالبا من كثافة الجسيمات في المنطقة المصورة ويمكن أن يقلل من التفاعلات بين الجسيمات وواجهة الهواء والماء. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتطبيق الجرافين على شبكات cryoEM وللتقييم السريع للمحبة المائية النسبية للشبكات الناتجة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف طريقة قائمة على EM لتأكيد وجود الجرافين من خلال تصور نمط الحيود المميز. أخيرا ، نوضح فائدة دعامات الجرافين هذه من خلال إعادة بناء خريطة كثافة دقة 2.7 Å لمجمع Cas9 بسرعة باستخدام عينة نقية بتركيز منخفض نسبيا.

Introduction

تطور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيم (cryoEM) إلى طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتصور الجزيئات البيولوجية^{الكبيرة 1}. مدعوما بالتقدم في الكشف المباشر عن الإلكترون^2،3،4 ، والحصول على البيانات⁵ ، وخوارزميات معالجة الصور^{6،7،8،9،10} ، أصبح cryoEM الآن قادرا على إنتاج هياكل ثلاثية الأبعاد قريبة من الدقة الذرية لعدد متزايد بسرعة من الجزيئات^{الكبيرة 11}

Protocol

1. إعداد الجرافين CVD

1. تحضير محلول نقش الجرافين كما هو موضح أدناه.
   1. قم بإذابة 4.6 جم من كبريتات الأمونيوم (APS) في 20 مل من الماء الجزيئي في دورق سعة 50 مل لمحلول 1 متر وقم بتغطيته بورق الألمنيوم. السماح APS ليذوب تماما أثناء المتابعة إلى الخطوة 1.2.
2. تحضير قسم من الجرافين CVD لطلاء ميثاكريلات الميثيل (MMA). قطع بعناية قسم مربع من الجرافين الأمراض القلبية الوعائية. انقل المربع إلى غطاء (50 مم × 24 مم) داخل طبق بتري نظيف وقم بتغطيته أثناء النقل إلى مغلف الدوران.
   ملاحظة: يجب أن ينتج مربع 18 مم × 18 مم 25-36 شبكة مطلية بالجرافين.

2. طلاء الجرافين CVD مع MMA

النتائج

سيؤدي التصنيع الناجح لشبكات cryoEM المطلية بالجرافين باستخدام المعدات (الشكل 1) والبروتوكول (الشكل 2) الموضحة هنا إلى طبقة أحادية من الجرافين تغطي ثقوب الرقائق التي يمكن تأكيدها من خلال نمط الحيود المميز. لتعزيز امتصاص البروتين على سطح الجرافين ، يمكن استخدام .......

Discussion

ينطوي تحضير عينات CryoEM على مجموعة من التحديات التقنية، حيث تتطلب معظم مهام سير العمل من الباحثين التعامل يدويا مع الشبكات الهشة بعناية فائقة لتجنب إتلافها. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن التنبؤ بقابلية أي عينة للتزجيج ؛ غالبا ما تتفاعل الجسيمات مع واجهة الهواء والماء أو مع رقائق الدعم الصلبة ا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216