نظام جرة زجاجية متعدد الاستخدامات لتوصيف إفرازات الجذر شبه المائية

Summary

نقدم بروتوكولا لنظام تجريبي شبه مائي قائم على الزجاج يدعم نمو مجموعة متنوعة من النباتات المتميزة من الناحية التطورية مع أو بدون ميكروبات. النظام متوافق مع وسائط النمو المختلفة ويسمح بأخذ عينات إفراز الجذر غير المدمرة لتحليل المصب.

Abstract

تشكل إفرازات الجذر واجهة النبات والتربة ، وتشارك في دورة المغذيات وتعديل التفاعلات مع الكائنات الحية في التربة. إفرازات الجذر ديناميكية وتتشكل من خلال الظروف البيولوجية والبيئية والتجريبية. نظرا لتنوعها الواسع وتركيزاتها المنخفضة ، يصعب تحديد ملامح الإفرازات الدقيقة ، حتى أكثر من ذلك في البيئات الطبيعية حيث توجد كائنات حية أخرى ، وتحويل المركبات المشتقة من النباتات وإنتاج مركبات إضافية بنفسها. يسمح النظام التجريبي للجرة الزجاجية شبه المائية الذي تم تقديمه هنا بالتحكم في العوامل البيولوجية والبيئية والتجريبية. يسمح بنمو أنواع نباتية مختلفة متميزة من الناحية التطورية لمدة تصل إلى عدة أشهر مع أو بدون ميكروبات ، في مجموعة متنوعة من وسائط النمو المختلفة. يوفر التصميم القائم على الزجاج خلفية مستقلب منخفضة لحساسية عالية وتأثير بيئي منخفض حيث يمكن إعادة استخدامه. يمكن أخذ عينات من الإفرازات بشكل غير مدمر ، ويمكن تغيير الظروف على مدار التجربة إذا رغبت في ذلك. الإعداد متوافق مع تحليلات قياس الطيف الكتلي وغيرها من الإجراءات التحليلية النهائية. باختصار ، نقدم نظام نمو متعدد الاستخدامات مناسب لتحليل إفرازات الجذر الحساسة في مجموعة متنوعة من الظروف.

Introduction

داخل التربة المكتظة بالسكان ، يقدم الجذور مكانة غنية بالكربون. يتشكل من جذور النباتات عن طريق نضح ما يصل إلى 20٪ من الكربون الممتص ويؤوي مجتمعات ميكروبية متميزة عن ميكروبيوم التربة المقيم^{1،2،3،4،5،6}. نظرا لأن الباحثين يستفيدون من الوظائف المفيدة للميكروبات المرتبطة بالجذور وإمكانات الزراعة المستدامة التي تصاحبها⁷ ، فإن هذه الملاحظة ، التي يطلق عليها غالبا تأثير الجذور ، كانت محور الجهود العلمية المتزايدة. ومع ذلك ، حتى الآن ، لا يزال الحوار الكيميائي بين الكائنات الحية الدقيقة والنباتات ، والذي يقترح أن يكون المحرك لتأثير الجذور ، غير مفهوم بشكل جيد ، وبالتالي ، فإن الفهم الميكانيكي لتطوير حلول ميكروبية موثوقة في الزراعة محدود^8،9،10.

إن فك رموز إفرازات الجذور في بيئات التربة حيث تمتص جزيئات التربة المستقلبات بسهولة وتحولها المجتمعات الميكروبية بسرعة ليس بالأمر السهل ، خاصة بالنسبة للأنواع النباتية ذات الأنظمة الجذرية الدقيقة مثل النبات النموذجي Arabidopsis thaliana¹¹. لهذا السبب ، في معظم الدراسات ، يتم أخذ عينات من إفرازات الجذر من أنظمة الزراعة المائية. في هذه العوالم المصغرة ، يتم تثبيت الأجزاء الهوائية من النباتات في مكانها بواسطة حاملات نباتات مخصصة أو مواد منخفضة المستوى مثل الخرز الشبكي والأجار والزجاجي. تتراوح الحاويات المستخدمة من أطباق بتري على ألواح متعددة الآبار إلى صناديق مخصصة وتجارية مختلفة مع أو بدون مرشحات تهوية^{12،13،14،15،16،17،18،19}. اعتمادا على النظام ، ستختلف ظروف نمو النبات اختلافا كبيرا وتعكس الظروف الطبيعية بدرجة أكبر أو أقل.

هنا ، نقدم نظاما شبه مائي قائم على الزجاج قابل للتعديل تجريبيا وينتج نتائج قابلة للتكرار بدرجة كبيرة. إنه سهل التجميع والاستخدام ويعتمد على المواد المتاحة بشكل شائع. يعتمد النظام على جرة زجاجية مملوءة بالخرز الزجاجي ، مع الاستفادة من الطبيعة القابلة لإعادة الاستخدام وخصائص الربط المنخفضة للأواني الزجاجية (الشكل 1). توفر الخرزات الدعم المادي للنبات المتنامي وتحاكي المعاوقة الميكانيكية ، مما يساهم في المزيد من بنية الجذر الشبيهة بالتربة عند مقارنتها بإعدادات الزراعة المائية^19،20،21. إذا تم تلقيحها بالميكروبات ، فإن الخرز الزجاجي يقدم أسطحا تلتصق بها البكتيريا.

يمكن إغلاق الجرة الزجاجية للحفاظ على العقم وتم تصميم النظام للسماح بمساحة كافية للرأس ودوران الهواء ، وتجنب البيئة المشبعة بالرطوبة. الجرار مناسبة للنمو المطول لأنواع النباتات المختلفة ويمكن زيادتها لأعلى ولأسفل باستخدام برطمانات مختلفة الحجم. هنا ، يتم عرض تطبيقات لستة أنواع نباتية ، تغطي الأعشاب C3 و C4 ، وثنائيات الفلقة ، والبقوليات. من بينها الأنواع النموذجية A. thaliana (dicot) ، Brachypodium distachyon (C3 monocot) ، Medicago truncatula (البقوليات) ، بالإضافة إلى أنواع المحاصيل مثل Solanum lycopersicum (الطماطم ، dicot) ، Triticum aestivum (القمح ، C3 أحادي الفلقة) ، والذرة الرفيعة ثنائية اللون (الذرة الرفيعة ، C4 أحادي الفلقة). يتضمن البروتوكول المقدم الإعداد التجريبي للنظام ، وتعقيم البذور وإنبات ستة أنواع نباتية ، وزرع الشتلات في الجرار ، ووسائط النمو المختلفة ، وتلقيح الميكروبات ، وأخذ عينات من إفرازات الجذر ، ومعالجة الإفرازات للتحليلات.

Protocol

1. تحضير الشتلات: تعقيم سطح البذور

ملاحظة: يجب أن يتم تعقيم سطح البذور وجميع الخطوات التالية في ظروف معقمة ما لم يذكر خلاف ذلك. الخطوات من 1.1 إلى 1.4 مخصصة للتعقيم السطحي لبذور A. thaliana . الأنواع النباتية الأخرى لها اختلافات بديلة في حجم الأنبوب (اعتمادا على عدد البذور وحجم البذور) ، والوقت في المحاليل ، ومحاليل التعقيم (الجدول 1).

1. أضف البذور إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (بحد أقصى 20 مجم من البذور) وقم بتغطية البذور بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   تنبيه: الإيثانول قابل للاشتعال. لا تستخدم بالقرب من اللهب المكشوف.
2. انقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المغلقة إلى شاكر لمدة 15 دقيقة ، واضبط الدوران بحيث يتم تحريك البذور برفق.
3. قم بإزالة 70٪ من الإيثانول بعناية باستخدام ماصة واستبدله بإيثانول 100٪. كرر الخطوة 1.2.
4. قم بإزالة الإيثانول بنسبة 100٪ وجفف البذور عن طريق ترك أغطية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مفتوحة في تدفق هواء معقم.
5. بمجرد أن تجف البذور ، انشرها بالتساوي على وسط 0.5x Murashige و Skoog (MS) مع 0.7٪ أجار نباتي عن طريق تحريك الأنبوب أو استخدام ملقط معقم. أغلق ألواح الآجار وختمها بشريط مسام صغير 1.25 سم.
6. ضع الألواح أفقيا على رف في غرفة النمو (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة ، 22 درجة مئوية نهارا / 18 درجة مئوية ليلا ، 150-160 ميكرولتر م ^-2 ثانية ^-1).

2. تحضير الشتلات: نقل البذور النابتة إلى أطباق طازجة

ملاحظة: الخطوات التالية خاصة ب A. thaliana وليست ضرورية للأنواع الأخرى.

1. بعد الإنبات ، انقل 5 إلى 6 شتلات إلى ألواح أجار نباتية جديدة بنسبة 0.7٪ بوسط 0.5x MS عن طريق وضع الشتلات خطيا ، على بعد حوالي 3 سم من الأعلى (انظر موضع الوردة في الشكل 2 د).
2. ختم ألواح أجار بشريط مسام صغير 1.25 سم وتنمو عموديا في غرفة النمو (الشكل 2 د) حتى تصبح الشتلات جاهزة للنقل إلى الجرار في 15-18 يوما بعد الإنبات (الجدول 2).

3. إعداد نظام الزراعة المائية: إعداد جرة

1. أضف 150 مل من الخرز الزجاجي النظيف 5 مم إلى كل برطمان نظيف وأغلقه بالغطاء (الشكل 1 أ).
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تعتبر الخرز الزجاجي 5 مم مناسبة لمعظم الأنواع²² ، ولكن يمكن تعديل حجم الخرزة إذا رغبت في ذلك.
2. ضع كمية كافية من ورق الألمنيوم فوق البرطمانات المغلقة لتغطية تقاطع الغطاء إلى الجرة والأوتوكلاف (121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة) (الشكل 1 ب).
3. احتفظ بالجرار المعدة مغطاة حتى تصبح النباتات جاهزة للنقل (الجدول 2).

4. إعداد نظام الزراعة المائية: إضافة الشتلات

1. عندما تكون الشتلات جاهزة للنقل إلى الجرار (الجدول 2) ، قم بإزالة رقائق الألومنيوم وأغطية الجرار في المقعد المعقم.
2. إذا كان سيتم تلقيح البرطمانات بالبكتيريا ، فقم بتنفيذ الخطوات التالية قبل الانتقال إلى الخطوة 4.3 ؛ وإلا، فتخط الخطوة 4.2.
   1. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، اختر مستعمرات مفردة من مزارع بكتيرية نقية على ألواح أجار وعلقها في 750 ميكرولتر من 10 mM MgCl₂ المعقم. كرر حتى يصبح المحلول عكرا.
   2. اختياري: اغسل التعليق 3x ب 750 ميكرولتر من الطرد المركزي المعقم 10 mM MgCl₂ × 5 دقائق عند 1000 × جم ودرجة حرارة الغرفة متبوعا بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 750 ميكرولتر من 10 mM MgCl₂.
   3. اختياري: في حالة تلقيح عدة أنواع بكتيرية مختلفة ، امزج معلقات السلالات المفردة المحضرة في الخطوات 4.2.1-4.2.2 بنسب متساوية قبل المتابعة.
   4. اضبط الكثافة الضوئية عند الطول الموجي 600 نانومتر (OD₆₀₀) إلى 0.2-0.4 في وسط 0.5x MS (درجة الحموضة 5.7 إلى 5.9 ، معدلة باستخدام KOH) أو وسط نمو آخر مفضل (انظر الخطوة 4.3). قم بقياس OD₆₀₀ مرة أخرى للتحقق مما إذا كان المحلول مخففا بشكل صحيح.
      تحذير: KOH أكالة. ارتداء القفازات ومعطف المختبر.
   5. قم بتخفيف التعليق إلى OD₆₀₀ 0.002-0.004 في نفس الوسط (تخفيف 1: 100).
      ملاحظة: تعتمد كثافة الخلايا النهائية على السلالة البكتيرية المستخدمة ، ولكن في تجربتنا ، يتوافق هذا اللقاح مع ما يقرب من 3-6 × 10⁵ خلايا ^mL-1.
   6. أضف 35 مل من التخفيف النهائي لكل برطمان. أضف 35 مل من وسط النمو المعقم للتحكم في البرطمانات. حرك الخرزات لتغطيتها بالتساوي بوسائط 0.5x MS قبل نقل النبات حتى لا تجف الجذور. انتقل إلى الخطوة 4.4.
3. أضف 35 مل من متوسط 0.5x MS إلى كل برطمان (درجة الحموضة 5.7 إلى 5.9 ، اضبط باستخدام KOH). حرك الخرزات لتغطيتها بالتساوي بوسائط 0.5x MS قبل نقل النبات حتى لا تجف الجذور.
   ملاحظة: يمكن تعديل وسط النمو ، على سبيل المثال ، عن طريق إزالة العناصر الغذائية ، أو إضافة الأسموليت للحث على إجهاد الملح ، أو استخدام قيم أس هيدروجيني مختلفة أو وسائط نمو. تحذير: KOH أكالة. ارتداء القفازات ومعطف المختبر.
4. ضع 3-5 نباتات A. thaliana في جرة عن طريق وضع أنظمة الجذر بين الخرز الزجاجي.
   ملاحظة: يختلف عدد النباتات لكل جرة بالنسبة للأنواع الأخرى (الجدول 2).
5. حرك الخرزات باستخدام ملقط أو ملاعق معقمة لتغطية الجذور ورفع الأوراق من الوسائط (الشكل 1 ج).
   ملاحظة: حرك النباتات والخرز بعناية لتجنب كسر الجذور والضغط على النباتات.
6. أضف شريحتين من شريط micropore مقاس 1.25 سم عبر الجزء العلوي من البرطمانات وضع الغطاء برفق في الأعلى (الشكل 1D-F).
   ملاحظة: لا تضغط على الغطاء لأسفل لتجنب إعاقة تبادل الهواء.
7. قم بتغطية الفجوة بين الغطاء والجرة بشريط مسام صغير 2.5 سم للحفاظ على العقم مع السماح بتبادل الهواء ، وضع البرطمانات في غرفة النمو (الشكل 1G ، H).
8. قم بإعداد 4-8 برطمانات لكل حالة تجريبية ، اعتمادا على السؤال البيولوجي والتباين المتوقع.
9. تأكد من تضمين الضوابط السلبية البيولوجية (على سبيل المثال ، الجرار بدون نباتات) لحساب خلفية الأيض للنظام التجريبي. قم بإعداد نفس العدد من النسخ المتماثلة للضوابط السلبية كما هو الحال في العلاجات التجريبية (على سبيل المثال ، رباعيات النسخ).
10. لفترات النمو الممتدة ، استبدل وسط النمو أسبوعيا: قم بإزالة ما تبقى من وسط النمو بماصة حجمية سعة 25 مل وأضف 35 مل من الوسط الطازج.

5. جمع الافرازات الجذر

1. عندما تصل النباتات إلى العمر المطلوب ، قم بإزالة شريط micropore مقاس 2.5 سم والغطاء في المقعد المعقم.
   ملاحظة: بالنسبة ل A. thaliana في ظروف نمونا ، يمثل 21 يوما بعد الإنبات مرحلة نباتية ناضجة قبل بداية الإزهار. مرحلة التطور الخضري خاصة بالأنواع النباتية ، ويتغير توقيت فترة النمو مع الأنواع النباتية ؛ يمكن تعديل هذا التوقيت اعتمادا على سؤال البحث.
2. لاختبار العقم ، قسمة 20 ميكرولتر من وسط النمو وماصة على ألواح أجار LB.
   1. بالنسبة للبرطمانات الملقحة ، يتم احتساب 100 ميكرولتر من وسط النمو لاستخدامها في وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) (على سبيل المثال ، في سلسلة التخفيف²³).
      ملاحظة: في تجربتنا ، تتراوح الكثافة البكتيرية في حدود 10^{5-10 8} خلايا حية ^mL-1 من وسط النمو.
3. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط النمو باستخدام ماصة حجمية سعة 25 مل ، وتجنب تلف الجذور.
4. أضف 50 مل من وسط التجميع (على سبيل المثال ، 20 مللي متر من أسيتات الأمونيوم ؛ درجة الحموضة 5.7-5.9 معدلة باستخدام حمض الهيدروكلوريك) عن طريق السحب على طول جدران الجرة لتجنب ترطيب الأوراق. أغلق الجرار بأغطية واحتضانها في ظروف معقمة للوقت المطلوب لجمع الإفرازات. بالنسبة للتجارب الحساسة للوقت ، 2 ساعة هي نافذة تجميع جيدة.
   تنبيه: حمض الهيدروكلوريك أكالة. ارتداء القفازات ومعطف المختبر. لأوقات أطول لجمع إفرازات الجذر ، لف الأغطية مرة أخرى بشريط وانقل البرطمانات إلى غرفة النمو.
5. بعد ساعتين ، قم بإزالة الكمية المطلوبة من وسائط الجمع في أنابيب (على سبيل المثال ، 50 مل للمقايسات أو التحليلات باستخدام الإفرازات المركزة ، أو 2 مل للاستخدام المباشر). قم بتخزين إفرازات الجذر المجمعة عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة أو التحليل.
   1. عند العمل مع الجرار الملقحة ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالإفرازات المجمعة لمدة 10 دقائق عند 5000 × جم و 4 درجات مئوية واستخدام المواد الطافية فقط للتحليل. بدلا من ذلك ، قم بتعقيم الإفرازات بالترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر أو 0.45 ميكرومتر.
6. إذا كانت التجربة جزءا من سلسلة زمنية ، فقم بإزالة جميع وسائط التجميع المتبقية من الجرار وأضف 35 مل من متوسط 0.5x MS. استبدل الغطاء والشريط 2.5 سم قبل إعادة الجرار إلى غرفة النمو.
7. قم بقياس الجذر وأطلق النار على الوزن الطازج لجميع النباتات في جرة واحدة لتطبيع إفرازات الجذر لاحقا حسب وزن النبات.
   ملاحظة: يمكن أخذ عينات من الأنسجة النباتية بالإضافة إلى ذلك إذا رغبت في ذلك.

6. معالجة إفرازات الجذر لقياس الطيف الكتلي

1. اعتمادا على الطريقة التحليلية ، قم بتجميد وتجفيف إفرازات الجذر للتركيز وإزالة وسط التجميع (-80 درجة مئوية عند 0.37 ملي بار حتى لا يوجد سائل). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للتحليل.
   ملاحظة: تم إنشاء البيانات المقدمة هنا باستخدام تحليل TOF-MS لحقن التدفق على أداة دقيقة رباعية الأقطاب لوقت الطيران.
2. قبل الحقن في الأداة التحليلية ، أعد تكوين الإفرازات المجففة بالتجميد أو قم بتخفيف إفرازات الجذر غير المعالجة باستخدام وسيط التجميع وفقا لوزن الجذر الطازج.
   ملاحظة: تم اختيار وسيط التجميع ليكون متوافقا مع مطياف الكتلة. ومع ذلك ، اعتمادا على الطريقة التحليلية ، قد تكون خطوات التحلية ضرورية قبل الحقن.

النتائج

يسمح النظام التجريبي المقدم هنا بالتحكم في العوامل التجريبية والبيئية التي تغير ملامح نضح الجذر. قارنا نمو A. thaliana في ظل ظروف الإضاءة المختلفة ، وعمر النبات ، وكثافات النبات عبر مختبرين مختلفين (الشكل 3). بدت النباتات صحية عبر المختبرات (الشكل 3 أ ، ب). أدت ظروف اليوم القصير (أضواء 10 ساعات مقابل 16 ساعة ضوء ، الشكل 3) إلى ارتفاع كتلة الجذر مقارنة بظروف اليوم الطويل (الشكل 3C ، D). وبالمثل ، كانت الكتلة الجذرية الكلية لجميع النباتات المزروعة في ظروف الأيام الطويلة أصغر مما كانت عليه في يوم قصير (الشكل 3C). بشكل عام ، كان تباين النمو داخل وبين الجرار منخفضا عبر المختبرات.

يتوافق نظام الجرة الزجاجية مع مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية ومراحل النمو. عادة ما تكون نقطة النهاية لتحليل إفرازات الجذر 21 يوما ، كما هو الحال في ظروفنا التجريبية ، تكون العديد من الأنواع النباتية في مرحلة نباتية ناضجة قبل الانتقال إلى مرحلة التكاثر (الشكل 4A-E). يمكن بسهولة إزالة النباتات من النظام التجريبي دون تلف واضح لنظام الجذر. وبالتالي ، فإن تحديد أوزان الأنسجة أو استخدام الأنسجة لتحليل المصب أمر بسيط. تم العثور على أعلى أوزان البراعم للقمح ، تليها الذرة الرفيعة والطماطم. تم العثور على أعلى أوزان الجذر للذرة الرفيعة ، تليها القمح و M. truncatula. تختلف نسبة الجذر: تبادل لاطلاق النار بين الأنواع. بشكل عام ، تراوحت أوزان الأنسجة بين 100 مجم و 800 مجم.

أحد الجوانب المركزية للأنظمة التجريبية التي تسمح بجمع إفرازات الجذر هو التلقيح المتحكم فيه بالميكروبات لدراسة تفاعلات النبات والميكروب في بيئة محددة. يمكن الحفاظ على النظام التجريبي المقدم معقما حتى مع التلاعب المتكرر (انظر حالة "التحكم" في الشكل 5) ، ويمكن إضافة البكتيريا والحفاظ عليها لفترات طويلة. عندما تم تلقيح نباتات A. thaliana البالغة من العمر 33 يوما بمزيج من البكتيريا المتعايشة عند OD₆₀₀ 0.004 ، استمرت البكتيريا لمدة 12 يوما ، وهي المدة الكاملة للتجربة (الشكل 5). حتى أن وحدات تشكيل المستعمرات زادت 100 ضعف في وسط النمو واستعمرت الجذور أيضا (الشكل 5 ج). لا يمكن تمييز الأنماط الظاهرية للنباتات الملقحة عن تلك الموجودة في النباتات المعقمة (الشكل 5 أ ، ب).

يسمح النظام التجريبي المقدم بجمع الإفرازات في العديد من الظروف التجريبية. هنا ، نقدم ملامح نضح A. thaliana Col-0 التي تم جمعها إما في أسيتات الأمونيوم أو في الماء من نفس النباتات على التوالي (الشكل 6 أ). تم تخزين الإفرازات عند -80 درجة مئوية حتى التحليل ، وتطبيعها بوزن الجذر ، وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة. تم ترشيح عينات من الجرار التي تحتوي على نباتات مقابل الضوابط التجريبية (الجرار بدون نباتات). من بين 2163 مستقلبا ، أظهر 436 إشارة فوق الخلفية (20.16٪) وتم الاحتفاظ بها للتحليل. من بين هؤلاء ، أظهر 416 أو 95٪ من المركبات وفرة مميزة بين الظروف التجريبية. ومع ذلك ، لا يمكن أن يعزى 26 مستقلبا إلى أي نوع من المركبات وبالتالي لم يتم تعريفها. كانت معظم المستقلبات (406 أو 98٪) أكثر وفرة في الإفرازات التي يتم جمعها من الماء. قد تؤثر المجموعة المتتالية من الإفرازات أولا في أسيتات الأمونيوم وبعد ذلك في الماء على ملف النضح ، حيث قد تخفف الإشارات الأيضية بمرور الوقت. ومع ذلك ، فإن إشارة النضح الأعلى بشكل حصري تقريبا في الماء الذي يتم جمعه كنقطة زمنية ثانية لا تدعم هذه الفرضية: من المحتمل أن يؤدي جمع الإفرازات في الماء النقي إلى حدوث صدمة تناضحية للنباتات ، مما يؤدي إلى زيادة وفرة المستقلب مقارنة بمكافئ مذيب التجميع لمحلول النمو (20 mM أسيتات الأمونيوم متساوية المولي إلى 0.5x MS متوسط). أظهر التحقيق في الفئات الكيميائية للمركبات المحددة لكلتا حالتي النمو أن غالبية المركبات عبارة عن أحماض ومشتقات عضوية (28.6٪) تليها مركبات الأكسجين العضوية (18٪) والمركبات الحلقية العضوية (14.2٪) والدهون (13.2٪). تنتمي مجموعة فرعية صغيرة فقط من المستقلبات إلى فينيل بروبانويدس وبوليكيتيدات (8.7٪) وبنزينويدات (6٪). تمثل مركبات النيتروجين العضوية والنيوكليوسيدات ومركبات الكبريت العضوي والقلويات والقشور والمركبات ذات الصلة ما بين 2٪ و 0.5٪ من المركبات المصنفة (الشكل 6 ب). يتوافق توزيع المستقلبات الموضحة هنا مع البيانات المنشورة بالفعل باستخدام أنواع أخرى من أنظمة جمع إفرازات الجذر²⁴.

الشكل 1: إعداد الجرة الزجاجية. أ: جرة بها خرز زجاجي. (ب) جرة بها خرز زجاجي جاهز للتعقيم. (ج) الشتلات في الجرار (منظر علوي). (د) شتلات في برطمان (منظر علوي) بشريط مسام صغير طوله 1.25 سم. (ه) شتلات في برطمانات (منظر جانبي) بشريط مسام صغير 1.25 سم. (F) شتلات في برطمانات (منظر جانبي) بشريط ومسام دقيقة 1.25 سم وغطاء. (ز) إعداد الجرة الكامل مع الشتلات في الجرار (منظر جانبي) بشريط مسام دقيقة 1.25 سم وغطاء وشريط مسام دقيقة 2.5 سم. (H) إعداد الجرة الكامل (منظر علوي). (ط) نباتات عمرها 21 يوما وجاهزة للحصاد (منظر علوي). حجم الجرة 147 مم ارتفاع × قطر 100 مم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: شتلات معقمة سطحيا على صفائح أجار متوسطة 0.5x Murashige و Skoog في غرفة النمو. (أ) أرابيدوبسيس ثاليانا (6 أيام)، (ب) براكيبوديوم ديستاتشيون (6 أيام)، (ج) ميديكاغو ترونكاتولا (6 أيام)، (د) أ. ثاليانا (18 يوما). حجم لوحة أجار 120 مم × 120 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: نباتات أرابيدوبسيس ثاليانا Col-0 تنمو في برطمانات في ظل ظروف الإضاءة في النهار القصير والطويل. (أ) جرة بها ثلاثة نباتات عمرها 33 يوما تزرع في ظروف يوم قصير (10 ساعات فاتحة / 14 ساعة مظلمة ، 220 ميكرومول م ^{-2 S-1} شدة الضوء ، 21 درجة مئوية نهارا / 18 درجة مئوية ليلا) و (ب) جرة بها خمسة نباتات عمرها 21 يوما تزرع في ظروف يوم طويل (16 ساعة فاتحة / 8 ساعات مظلمة ، 150-160 μmol ^{m-2 s-1} شدة الضوء ، 22 درجة مئوية ليلا / 18 درجة مئوية ليلا). وزن جذر (ج) جميع نباتات الجرة الواحدة و (د) من النباتات المفردة. ** تمثل قيم دلالة اختبار t (p < 0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: خمسة أنواع متميزة سلاليا في اليوم 21 في إعداد نظام الجرة الزجاجية المعقمة. (أ) نموذج أحادي الفلقة Brachypodium distachyon ، (ب) نموذج البقوليات Medicago truncatula ، (ج) ثنائي الفلقة Solanum lycopersicum (الطماطم) ، (د) ثنائي الفلقة الذرة الرفيعة ثنائي اللون ، (E) أحادي الفلقة Triticum aestivum (القمح). (و) الوزن الطازج للجذور وبراعم الأنواع المزروعة في الجرار الزجاجية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: أرابيدوبسيس ثاليانا Col-0 (33 يوما) نمت في ظروف يوم قصير. أ: في بيئة معقمة أو (ب) ملقحة لمدة 12 يوما باتحاد من البكتيريا المتعايشة. (ج) وحدات تشكيل مستعمرة للجرار المعقمة (التحكم) والملقحة لركيزة النمو (يسار) والجذر (يمين). N = 4 برطمانات لحالة التحكم المعقمة ، و n = 8 برطمانات للحالة الملقحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: ملامح إفرازات الجذر المميزة ل A. thaliana Col-0 البالغة من العمر 21 يوما. تم جمع الإفرازات لمدة 2 ساعة في أسيتات الأمونيوم المعقمة 20 mM (درجة الحموضة 5.7) تليها مجموعة 2 h في الماء مفلتر منزوع الأيونات معقم. تم الكشف عن المستقلبات عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام الحقن المباشر. (أ) تحليل المكون الرئيسي ل 436 مستقلبا تم اكتشافها فوق مستوى الخلفية (مقارنة الجرار مع النباتات مقابل الجرار بدون نباتات). PC: المكون الرئيسي مع شرح مقدار التباين. الأزرق: الإفرازات المجمعة بالماء ، الأصفر: الإفرازات المجمعة من أسيتات الأمونيوم. (ب) مخطط دائري مكون من 416 مستقلبا يختلف اختلافا كبيرا بين الظروف التجريبية (اختبار Tukey) ملون وفقا للفئة الفائقة (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جنس		إعداد البذور	الوقت في 70٪ إيثانول (دقيقة)	تركيز هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) (v / v٪ مبيض)		الوقت في التبييض (دقيقة)
أرابيدوبسيس ثاليانا			15	اي; 100٪ إيثانول		15
براشيبوديوم ديستاتشيون *		ديهوسك	0.5	6		5
ميديكاغو ترونكاتولا * أ			30	6		30
سولانوم ليكوبيرسيكوم *			0.5	6		5
الذرة الرفيعة ثنائية اللون*		ديهوسك	0.5	6		30
تريتيكوم إيستيفوم*		ديهوسك	0.5	12		20

الجدول 1: طرق تعقيم البذور السطحية لأنواع متعددة. * غسلها 4-5x بالماء منزوع الأيونات المصفى بين الإيثانول والمبيض وفي النهاية ؛ ^حضانةلمدة 3-6 ساعات بعد التبييض ، مع استبدالها بالماء منزوع الأيونات المصفى كل 30 دقيقة.

جنس	يوم الجرار	عدد النباتات
براشيبوديوم ديستاتشيون	4 إلى 5	3
الذرة الرفيعة ثنائية اللون	4 إلى 5	3
تريتيكوم إيستيفوم	4 إلى 5	2
ميديكاغو ترونكاتولا	5 إلى 6	3
سولانوم ليكوبرسيكوم	7 إلى 8	3
أرابيدوبسيس ثاليانا	17	3 إلى 5

الجدول 2: عمر الشتلات بالأيام لنقلها إلى الجرار وعدد النباتات لكل جرة لمختلف أنواع النباتات.

Discussion

يعتمد النظام التجريبي المعروض هنا على الجرار الزجاجية والخرز الزجاجي ، وبالتالي يوفر نظاما شبه مائي بسيط ومنخفض الصيانة ومتعدد الاستخدامات لدراسة نضح الجذور في سياقات مختلفة. وقد تم استخدامه في الدراسات التي تبحث في ملامح النضح لأنواع النباتات المختلفة²⁵ ، واستجابات النضح لظروف النمو المختلفة²⁵ ، وكذلك تأثير الخصائص الفيزيوكيميائية للتربة على النضح²². النظام مناسب لجميع الأنواع النباتية التي تم اختبارها هنا لفترات نمو ممتدة ، تتراوح من أسابيع إلى شهور. الحفاظ على الظروف المعقمة واضح ومباشر ، وكذلك التلقيح بالبكتيريا ، والتي تستمر خلال فترة النمو التي تم تحليلها لمدة 2 أسبوع. وبالتالي ، فإن النظام التجريبي لا يسمح فقط بجمع متحكم فيه من إفرازات الجذر في ظروف معقمة ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لدراسة تفاعلات الميكروبات النباتية. علاوة على ذلك ، يمكن تنويع وسائط نمو النبات لدراسة الاستجابات الأيضية لمستويات المغذيات المختلفة ، ويمكن تعديل فترات النمو عن طريق تكييف ظروف الإضاءة أو استخدام برطمانات مختلفة الحجم.

تظل دراسة إفرازات الجذر في الظروف المائية أو شبه المائية قياسية في هذا المجال ويرجع ذلك أساسا إلى الدقة المحسنة للمستقلبات منخفضة التركيز¹¹. تعتمد العديد من الأساليب المائية على أطباق بتري أو الأطباق متعددة الآبار أو الحاويات الصغيرة الأخرى التي تسمح بالعقم والإنتاجية العالية ولكنها تقيد التجارب على النباتات الصغيرة أو الشتلات المزروعة في بيئات عالية الرطوبة^{17،18،26،27}. في إعداد الجرة الزجاجية المقدمة ، يتم توفير مساحة رأس كافية بواسطة الجرار الكبيرة نسبيا ، مما يسمح بفترات نمو ممتدة. تعمل خطوط الشريط ذات المسام الدقيقة على تأمين تبادل الهواء مع الحفاظ على العقم. وبالتالي ، حتى أحاديات الفلقة الطويلة مثل الشعير والذرة يمكن زراعتها في إعداد الجرة الزجاجية لعدة أسابيع. يمكن دراسة النباتات الصغيرة مثل A. thaliana والبرسيم لمدة 4-5 أسابيع بعد الإنبات ، بما في ذلك المراحل النباتية والإنجابية.

تتوفر إعدادات الزراعة المائية البديلة للنباتات الكبيرة أيضا ، ولكنها غالبا ما تتطلب صناديق ومداخل مصنوعة حسب الطلب مصنوعة من شبكة وألواح رغوية وسلال نقش لدعم النبات^{15،28،29،30}. بالإضافة إلى ذلك ، لا يتم إعداد هذه الأجهزة عادة لتكون معقمة ، أو أنها تتطلب إجراءات إعداد وصيانة صعبة لإبقائها خالية من الملوثات الميكروبية و / أو الكيميائية. إعداد وصيانة العقم في النظام التجريبي المقدم واضح ومباشر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الزجاج للبرطمانات والخرز يقلل من وجود الملوثات التي تتسرب من البلاستيك ويوفر الموارد حيث يمكن غسلها وإعادة استخدامها بسهولة.

تم تطبيق الخرز الزجاجي سابقا لتقليد جزيئات التربة. أنها تحفز نمو الجذر الطبيعي في أجهزة أخذ عينات نضح الجذر مثل مصائد النضح³¹ أو غيرها من أنظمة شبه المائية¹⁹. يستفيد إعداد الجرة الزجاجية من هذا التطور ويقدم الخرزات كسطح استعمار للميكروبات. في التربة ، يتطور الميكروبيوم حول جذور النباتات في بيئة شبه صلبة ، مع جزيئات مدمجة ومساحات مملوءة بالهواء أو الماء. على الرغم من أن إعداد الجرة الزجاجية لا يتضمن تهوية نشطة لوسط النمو بسبب عدم احتواء المرحلة السائلة السفلية على مستويات أكسجين مثالية ، فإن الجمع بين حجم حبة أكبر مع حجم متوسط نمو أصغر يخلق مرحلة علوية رطبة ولكن جيدة التهوية حيث يمكن أن تنمو الميكروبات في ظل ظروف الأكسجين. اقترح آخرون هز حاويات النمو^26,28 أو استخدام الأنابيب المقترنة بمضخات الهواء^19,29 للحفاظ على إمداد الهواء في أنظمة النمو المائية. ومع ذلك ، فإن هذه الأنظمة إما أن تكون غير معقمة ، أو تتطلب مواد متخصصة ومراقبة مستمرة للحفاظ على العقم. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة الاهتزاز ، احرص كثيرا على تجنب غمر البراعم في محاليل النمو وتلف أنظمة الجذر. ومع ذلك ، إذا رغبت في ذلك ، يمكن تكييف الإعداد التجريبي المقدم بمواد إضافية للتهوية.

أحد الجوانب الحاسمة التي يجب مراعاتها في جميع دراسات التفاعل بين النبات والميكروب التي تبحث في عملية التمثيل الغذائي هو أن الميكروبات تتحلل المركبات المشتقة من النباتات وتنتج مستقلبات من تلقاء نفسها. بدون إعداد تجريبي معقم متخصص ، لا يمكن التمييز بين المستقلبات المشتقة من النباتات والميكروبات. لمنع النشاط الميكروبي وإثراء المركبات المشتقة من النباتات ، اقترح Oburger et al. التعقيم الكيميائي لمحلول أخذ عينات إفرازات الجذر لمنع التدهور البكتيري³². يمكن دراسة تأثير المثبطات الكيميائية في النظام التجريبي المقدم ، ومقارنة ملامح النضح للنباتات المعقمة مقابل النباتات غير المعقمة المعالجة بالمثبط أو بدونه.

يتمثل أحد القيود الرئيسية لإعداد الجرة الزجاجية المقدمة في أن ظروف النمو تظل مصطنعة للغاية مقارنة بالتربة. غالبا ما يتم جمع الإفرازات من النباتات المزروعة في التربة من أنظمة الترشيح¹³ ، حيث يتم تجميع تدفقات المذيبات في قاعدة حاويات النمو ، أو الأنظمة الهجينة المائية للتربة ، حيث تزرع النباتات في البداية في التربة ثم يتم نقلها إلى الظروف المائية^16,33. على عكس إعداد الجرة الزجاجية ، عادة ما تكون هذه الإجراءات مدمرة ، ولا تسمح بمجموعات متعددة بمرور الوقت في بيئات النمو المتغيرة. علاوة على ذلك ، بينما في أنظمة الترشيح ، يتم أخذ عينات من خلفية التربة مع الإفرازات ، في الأنظمة الهجينة المائية للتربة ، يتم التحايل على مشكلة الخلفية الأيضية العالية للتربة مع النقل إلى الظروف المائية لجمع الإفرازات. على الرغم من تنفيذ أوقات الاسترداد لتقليل تسرب المستقلب عبر الجذور المصابة¹¹ ، إلا أن نقل النبات مدمر للغاية ومن المرجح أن تستمر الجروح ، وقد يتغير التمثيل الغذائي للنبات استجابة للانتقال إلى الظروف المائية. علاوة على ذلك ، في كثير من الحالات ، تحدث صدمة تناضحية عن طريق نقل النباتات إلى الماء بدلا من محلول نمو مناسب^16,33. في البروتوكول المقدم ، يتم تبادل محلول النمو بمحلول متساوي المولي للحفاظ على التوازن التناضحي ، مع السماح بالتقاط النضح خلال نافذة زمنية قصيرة ومحددة. يعد تغيير محلول النمو ممارسة شائعة في العديد من الدراسات المنشورة ويمكن تحقيقه بسهولة في إعدادات الزراعة المائية دون جرح الجذر^{12،16،26،34}. نظرا لتعدد استخداماته ، يمكن بسهولة تكييف النظام التجريبي المقدم لتقليد المزيد من الظروف الطبيعية ، على سبيل المثال ، باستخدام مستخلص التربة المعقم أو غير المعقم كحل للنمو مع أو بدون وجود جزيئات التربة الصلبة. يسمح التغيير التدريجي نحو الظروف الطبيعية بدراسة تأثير خصائص التربة الفيزيوكيميائية المختلفة والوجود الميكروبي على استقلاب النبات وعلم وظائف الأعضاء. قبل أن يكون لدى المجتمع العلمي فهم جيد للنضح في بيئات مختلفة ، من المستحسن استخدام الأنظمة القائمة على التربة والمائية بالتوازي ، حيث أن كلا الإعدادين لهما مزاياهما وقيودهما¹³.

في الختام ، يبرز الإعداد التجريبي شبه المائي القائم على الزجاج بسبب بساطته جنبا إلى جنب مع التنوع العالي للتطبيقات. إنه يقدم طريقة سهلة الوصول ومنخفضة التكلفة لجمع ودراسة النضح في ظروف معقمة ، أو بالاشتراك مع الميكروبات والتفاعلات بين الميكروبات النباتية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar powder for bacteriology	VWR	20767.298
Aluminum foil	FORA GmbH
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301-1KG	ACS reagent, Eur >- 98%
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Broth, Lennox	BD	240210
Ethanol	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Filtered deionized water	Merck Millipore	Milli-Q IQ7000
Glass beads	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Hydrochloric acid	Merk	1.00317.1000
Inoculation loop	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Jars	Weck	105741	850 mL
Lyophilizer	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	2189.1
Matrix Orbital thermoshaker	IKA	10006248
Microcentrifuge tube	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP
Micropore tape	3M	1530-0	1.25 cm x 9.1 m
Micropore tape	3M	1530-1	2.5 cm x 9.1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Growth chamber	Percival	SE41-TLCU4	16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl	Carl Roth	9062.4
Square petri dish	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, with vents
Stericup Quick release	Millipore	S2GPU05RE	0.22 µm PES, 500 mL
Sterile bench	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18