تصوير الخلايا الحية المتعددة للاستجابات الدوائية في النماذج العضوية المشتقة من المريض للسرطان

Summary

عضويات الورم المشتقة من المريض هي نظام نموذجي متطور للبحوث الأساسية والانتقالية. توضح مقالة الطرق هذه بالتفصيل استخدام تصوير الخلايا الحية الفلورية المتعددة للتقييم الحركي المتزامن للأنماط الظاهرية العضوية المختلفة.

Abstract

نماذج السرطان العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي نظام بحث متعدد الوظائف يلخص بشكل أفضل الأمراض البشرية مقارنة بخطوط الخلايا السرطانية. يمكن إنشاء نماذج شركة تنمية نفط عمان عن طريق زراعة الخلايا السرطانية للمريض في مستخلصات الغشاء القاعدي خارج الخلية (BME) وطلاءها على شكل قباب ثلاثية الأبعاد. ومع ذلك ، فإن الكواشف المتاحة تجاريا والتي تم تحسينها لمقايسات النمط الظاهري في الثقافات أحادية الطبقة غالبا ما تكون غير متوافقة مع BME. هنا ، نصف طريقة للوحة نماذج PDO وتقييم آثار الدواء باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية الآلي. بالإضافة إلى ذلك ، نطبق أصباغ الفلورسنت المتوافقة مع القياسات الحركية لتحديد صحة الخلية وموت الخلايا المبرمج في وقت واحد. يمكن تخصيص التقاط الصور ليحدث على فترات زمنية منتظمة على مدار عدة أيام. يمكن للمستخدمين تحليل تأثيرات الدواء في صور Z-plane الفردية أو إسقاط Z للصور التسلسلية من مستويات بؤرية متعددة. باستخدام التقنيع ، يتم حساب معلمات محددة ذات أهمية ، مثل رقم PDO والمساحة وشدة التألق. نحن نقدم بيانات إثبات المفهوم التي توضح تأثير العوامل السامة للخلايا على صحة الخلايا ، وموت الخلايا المبرمج ، والجدوى. يمكن توسيع منصة التصوير الحركي الآلي هذه لتشمل قراءات النمط الظاهري الأخرى لفهم الآثار العلاجية المتنوعة في نماذج PDO للسرطان.

Introduction

تظهر عضويات الورم المشتقة من المريض (PDOs) بسرعة كنظام نموذجي قوي لدراسة تطور السرطان والاستجابات العلاجية. PDOs هي أنظمة زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) تلخص الملف الجينومي المعقد وبنية الورم الرئيسي ^1,2. على عكس الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) لخطوط الخلايا السرطانية الخالدة ، تلتقط PDOs وتحافظ على عدم التجانس داخل الورم ^3,4 ، مما يجعلها أداة قيمة لكل من البحث الميكانيكي والانتقالي. على الرغم من أن PDOs أصبحت نظاما نموذجيا شائعا بشكل متزايد ، إلا أن الكواشف المتاحة تجاريا وطرق التحليل للتأثيرات الخلوية المتوافقة مع ثقافات شركة تنمية نفط عمان محدودة.

إن عدم وجود طرق قوية لتحليل التغييرات الطفيفة في الاستجابة للعلاج يعيق الترجمة السريرية. يستخدم كاشف صحة الخلية القياسي الذهبي في الثقافات ثلاثية الأبعاد ، CellTiter-Glo 3D ، مستويات ATP كمحدد لصلاحية الخلية ^5,6. في حين أن هذا الكاشف مفيد لفحوصات نقطة النهاية ، إلا أن هناك العديد من المحاذير ، وأبرزها عدم القدرة على استخدام العينات لأغراض أخرى بعد الانتهاء من الفحص.

تصوير الخلايا الحية هو شكل متطور من الفحص المجهري الحركي الذي ، عند دمجه مع الكواشف الفلورية ، لديه القدرة على تحديد مجموعة متنوعة من قراءات صحة الخلايا ضمن نماذج PDO ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج^7،8،9 والسمية الخلوية¹⁰. في الواقع ، كان تصوير الخلايا الحية جزءا لا يتجزأ من الفحص عالي الإنتاجية للمركبات في منصات 2D ^11,12. جعلت أنظمة مثل Incucyte التكنولوجيا ميسورة التكلفة وبالتالي في متناول مجموعات البحث في مجموعة متنوعة من الإعدادات. ومع ذلك ، فإن تطبيق هذه الأنظمة لتحليل ثقافات 3D لا يزال في مهده.

هنا ، نصف طريقة لتقييم الاستجابة الدوائية في نماذج PDO للسرطان باستخدام تصوير الخلايا الحية المتعددة (الشكل 1). من خلال تحليل صور المجال الساطع ، يمكن مراقبة التغييرات في حجم شركة تنمية نفط عمان ومورفولوجيتها حركيا. علاوة على ذلك ، يمكن قياس العمليات الخلوية في وقت واحد بمرور الوقت باستخدام الكواشف الفلورية ، مثل Annexin V Red Dye لموت الخلايا المبرمج و Cytotox Green Dye للسمية الخلوية. تم تحسين الطرق المقدمة لنظام تصوير الخلايا الحية Cytation 5 ، ولكن يمكن تكييف هذا البروتوكول عبر منصات تصوير الخلايا الحية المختلفة.

Protocol

تمت مراجعة الدراسات التي تستخدم عينات الورم البشري والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة أيوا (IRB) ، البروتوكول #201809807 ، وتم إجراؤها وفقا للمعايير الأخلاقية على النحو المنصوص عليه في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع الأشخاص المشاركين في الدراسة. تشمل معايير التضمين تشخيص السرطان وتوافر عينات الورم.

1. طلاء PDOs سليمة في لوحة 96 بئر

1. تحضير الكواشف.
   1. سخن ألواح 96 بئرا عند 37 درجة مئوية طوال الليل وقم بإذابة BME طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإعداد وسائط ثقافة عضوية كاملة محسنة لزراعة نوع السرطان محل الاهتمام. وترد في الجدول التكميلي 1 وسائط استزراع محددة مستخدمة للتجارب المبينة هنا.
      ملاحظة: قد تحتاج مكونات الوسائط إلى التعديل لأنواع الأورام المختلفة. على سبيل المثال ، يتم استكمال وسائط الثقافة العضوية مع استراديول 100 نانومتر لأورام النساء¹³. الوسائط المعدة مستقرة عند 4 °C لمدة 1 شهر. للتخزين طويل الأجل ، قم بتقسيم الوسائط إلى أنابيب سعة 50 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2. تحضير حصتين منفصلتين من وسائط الاستزراع العضوي عند 4 درجات مئوية و 37 درجة مئوية. على سبيل المثال ، إذا تم طلاء 60 بئرا في صفيحة 96 بئرا ، فاستخدم 6 مل من وسائط الاستزراع العضوي الدافئ و 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع العضوي الباردة الجليدية.
3. تحضير عازلة للغسيل العضوي: تكملة 1x PBS مع 10 mM HEPES ، 1x Glutamax ، 5 mM EDTA ، و 10 μM Y-27632. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية
4. حصاد PDOs المستزرعة في لوحة 24 بئر. نفذ جميع الخطوات على الجليد أو عند 4 درجات مئوية ما لم يذكر خلاف ذلك.
   1. نضح الوسائط من كل بئر باستخدام نظام خط التفريغ.
   2. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل العضوي المثلج البارد وماصة بلطف 2-3x باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. احتضان الطبق على الجليد لمدة 10 دقائق.
   3. انقل محتويات كل بئر إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. للتأكد من أن جميع PDOs معلقة ، اشطف كل بئر ب 300 ميكرولتر إضافية من المخزن المؤقت للغسيل العضوي وانقله إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية
   4. نضح المادة الطافية من BME / الحبيبات العضوية باستخدام نظام خط فراغ ، وترك ~ 5 مل المتبقية في الأنبوب. أضف 20 مل من المخزن المؤقت للغسيل العضوي وأعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق.
   5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 350 × جم عند 4 درجات مئوية. نضح المادة الطافية بنظام خط فراغ ، مع الحرص على عدم تعطيل حبيبات PDO.
5. طلاء PDOs في لوحة 96 بئرا: قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك.
   1. أعد تعليق حبيبات PDO في كمية مناسبة من وسائط الاستزراع العضوي المثلج البارد لإنشاء تعليق PDO. انقل تعليق PDO إلى أنبوب طرد مركزي صغير بارد سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: لحساب كمية وسائط الاستزراع العضوي ، حدد عدد الآبار التي سيتم طلاؤها في صفيحة 96 بئرا ، مع الأخذ في الاعتبار أن PDOs مطلية في قبة 5 ميكرولتر بنسبة 1: 1 من وسائط الاستزراع العضوي و BME. على سبيل المثال ، عند طلاء لوحة واحدة من 96 بئرا واستخدام 60 بئرا داخلية فقط ، فإن إجمالي كمية تعليق PDO المطلوبة سيكون 300 ميكرولتر: 150 ميكرولتر من وسائط الاستزراع العضوي و 150 ميكرولتر BME. بالنسبة للنماذج التي تظهر نموا مثاليا بنسب مختلفة من BME ، يمكن تعديل نسبة BME: الوسائط في هذه الخطوة ، على الرغم من أنه من المهم توحيد النسبة عبر جميع المقايسات لكل نموذج محدد. لحساب خطأ السحب ، أضف حجما بنسبة 10٪ لكل مكون.
   2. احسب عدد PDOs.
      1. انقل 2.5 ميكرولتر من معلق PDO إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بارد سعة 1.5 مل واخلطه مع 2.5 ميكرولتر من BME. انقل الخليط سعة 5 ميكرولتر إلى شريحة مجهر زجاجية نظيفة. لا تغطي الشريحة. سوف يتجمد الخليط في قبة.
      2. تصور باستخدام مجهر المجال الساطع في 4x. حساب عدد PDOs في خليط 5 ميكرولتر ؛ الهدف هو الحصول على ما يقرب من 25-50 PDOs لكل قبة 5 ميكرولتر.
         ملاحظة: إذا لم يتم تحقيق الكثافة المطلوبة في خليط الاختبار ، فاضبط الحجم النهائي لتعليق PDO إما عن طريق إضافة المزيد من وسائط الاستزراع العضوي أو الطرد المركزي لتعليق PDO وتعليق حبيبات PDO في حجم أقل من وسائط الاستزراع العضوي المثلج البارد. بغض النظر عن كيفية تعديل تعليق PDO في هذه الخطوة ، فإن النسبة النهائية لتعليق BME: PDO في الخطوة 1.5.3. يجب أن يكون 1: 1.
   3. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع أطراف تجويف عريضة ، امزج تعليق PDO بعناية مع كمية متساوية من BME لتحقيق نسبة 1: 1 من وسائط الاستزراع العضوي إلى BME. تجنب الفقاعات ، والتي من شأنها تعطيل سلامة القباب.
   4. باستخدام ماصة 20 ميكرولتر ، يتم زرع قباب 5 ميكرولتر في وسط كل بئر من صفيحة 96 بئرا مسخنة مسبقا ، مع بذر 60 بئرا داخليا فقط. لضمان التوزيع المتساوي ل PDOs ، قم بسحب محتويات الأنبوب سعة 1.5 مل بشكل دوري باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر مع أطراف عريضة التجويف.
   5. بعد أن يتم زرع جميع الآبار ، ضع الغطاء على اللوحة واقلبها برفق. احتضان الصفيحة المقلوبة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في حاضنة زراعة الأنسجة للسماح للقباب بالتصلب.
      ملاحظة: يضمن عكس اللوحة أن قبة وسائط BME / الثقافة العضوية تحتفظ بهيكل 3D لتوفير مساحة كافية لتشكيل PDO.
   6. اقلب الطبق بحيث يكون جالسا مع رفع الغطاء واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.

2. العلاجات وإضافة الأصباغ الفلورية لتعدد الإرسال

1. بينما تتصلب قباب BME في صفائح 96 بئرا ، قم بإعداد تخفيفات كواشف تصوير الخلايا الحية الفلورية. وترد هنا معلمات محددة لتعدد الإرسال Annexin V Red Dye و Cytotox Green Dye.
2. تحضير الكاشف الفلوري (اليوم -1): احسب الحجم المناسب لوسائط الاستزراع العضوي بناء على عدد الآبار المراد معالجتها ، بافتراض أن كل بئر ستتم معالجته ب 100 ميكرولتر من الوسائط ذات الجرعات الصبغية. تمييع صبغة في وسائط الثقافة العضوية قبل التسخين إلى التركيز المطلوب.
   ملاحظة: سيختلف إجمالي كمية الوسائط المطلوبة حسب التجربة. أضف 10٪ إلى الحجم النهائي لحساب خطأ الماصة. على سبيل المثال ، لمعالجة 60 بئرا داخلية لصفيحة 96 بئرا ، قم بإعداد 6.6 مل من الوسائط ذات الجرعات الصبغية (الجدول 1).
3. عالج كل بئر ب 100 ميكرولتر من وسائط الثقافة العضوية ذات الجرعات الصبغية. أضف 200 ميكرولتر من 1x PBS المعقم إلى الآبار الفارغة الخارجية للوحة. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يقلل PBS في الآبار الطرفية من تبخر الوسائط من الآبار الداخلية.
4. إضافة الأدوية / عوامل العلاج (اليوم 0): تحضير الأدوية في وسائط استزراع عضوي تم تسخينها مسبقا بتركيز 2x بحجم 100 ميكرولتر لكل بئر.
   ملاحظة: يمكن أن يكون DMSO ساما للخلايا بتركيزات عالية. لم يتم تجاوز تركيز 0.1٪ DMSO في التجارب التي أجريت في هذه الدراسة. بالإضافة إلى الأدوية ، يتم توزيع بعض الكواشف الفلورية كحل DMSO. من المهم حساب التركيز الكلي DMSO عند العمل مع هذه الكواشف.
5. أضف 100 ميكرولتر من 2x وسائط مداوية بالصبغة إلى كل بئر ؛ تجنب خلق فقاعات.

3. إعداد معلمات التصوير

1. ضع اللوحة في Cytation 5. مفتوح برنامج Gen5. انقر فوق مهمة جديدة > الوضع اليدوي للتصوير. حدد Capture Now وأدخل الإعدادات التالية: الهدف (حدد التكبير المطلوب) ؛ مرشح (حدد الصفيحة الدقيقة) ؛ شكل الصفيحة الدقيقة (حدد عدد الآبار) ؛ ونوع السفينة (حدد نوع اللوحة). انقر فوق استخدام الغطاء واستخدام سرعة حاملة أبطأ. انقر فوق موافق.
   ملاحظة: نوع السفينة: كن محددا قدر الإمكان عند اختيار معلومات حول اللوحة لأن البرنامج تمت معايرته إلى المسافة المحددة من الهدف إلى أسفل اللوحة لكل نوع لوحة وسمك البلاستيك.
   سرعة الناقل الأبطأ: حدد هذا المربع لتجنب تعطيل القباب عند تحميل / تفريغ اللوحات.
2. قم بإنشاء Z-Stack الذي سيصور قبة BME بأكملها.
   1. حدد بئرا ذات أهمية لعرضها (اللوحة اليسرى ، أسفل الرسم البياني).
   2. حدد قناة الحقل الساطع (اللوحة اليسرى ، أعلى). انقر فوق التعريض التلقائي واضبط الإعدادات حسب الحاجة.
   3. اضبط الجزء السفلي والعلوي من علامة التبويب Z-Stack: توسيع وضع التصوير (اللوحة اليسرى ، المنتصف). حدد مربع Z-Stack . باستخدام أسهم ضبط المقرر الدراسي (اللوحة اليسرى ، المنتصف) ، انقر فوق الضبط لأسفل حتى تدخل جميع PDOs ثم تخرج عن التركيز وتكون غامضة. قم بتعيين هذا الجزء السفلي من Z-Stack. كرر في الاتجاه المعاكس باستخدام أسهم ضبط المسار لتعيين الجزء العلوي من Z-Stack.
   4. للتأكد من أن إعدادات Z-Stack مناسبة للآبار الأخرى ذات الأهمية ، حدد بئرا آخر (اللوحة اليسرى ، أسفل الرسم البياني) وتصور الجزء العلوي والسفلي من Z-Stack.
   5. لإدخال المواضع البؤرية يدويا ، انقر فوق النقاط الثلاث بجوار الضبط الدقيق (اللوحة اليسرى ، أعلى). سيتم فتح نافذة. اكتب في أعلى قيمة Z-Stack (الموجودة في اللوحة اليمنى، في المنتصف، ضمن وضع التصوير). كرر لقيمة Z-Stack السفلية. اضبط حسب الضرورة لالتقاط نطاق Z المطلوب بتكرار الخطوة 3.2.3. إذا كانت التعديلات ضرورية ، فحدد بئرا آخر للتحقق من الإعدادات.
3. اضبط إعدادات التعرض لقناة (قنوات) الفلورسنت. يتم وصف الإعدادات لقناتي فلورسنت (GFP و TRITC). يعتمد العدد المحدد لقنوات الفلورسنت على التجربة ومكعبات الفلورسنت المثبتة في نظام تصوير الخلايا الحية.
   ملاحظة: إذا كان من المتوقع أن تكون شدة الإشارة أعلى بكثير في نهاية التجربة ، فيجب على المستخدمين التفكير في إجراء تجارب اختبار لتحديد إعدادات التعرض المثلى في نهاية التجربة والتي يمكن تطبيقها بعد ذلك عند إعداد المعلمات الأولية.
   1. قم بتوسيع علامة التبويب وضع التصوير (اللوحة اليسرى ، في المنتصف) وافتح تحرير خطوة التصوير. ستظهر نافذة منبثقة.
   2. ضمن القنوات ، انقر فوق الفقاعة للحصول على العدد المطلوب من القنوات. عين قناة واحدة للمجال الساطع وقنوات إضافية لكل قناة فلورسنت. في هذا المثال ، القناة 1 = حقل ساطع ؛ القناة 2 = هيئة أجيال السلام ؛ القناة 3 = TRITC. باستخدام القوائم المنسدلة Color ، حدد الإعداد المناسب لكل قناة. أغلق نافذة التحرير بالنقر فوق موافق.
   3. قم بإعداد كل قناة فلورسنت.
      1. قم بتبديل القناة إلى GFP (اللوحة اليسرى ، أعلى).
      2. انقر فوق التعريض التلقائي (اللوحة اليسرى ، أعلى). قم بتوسيع علامة التبويب التعرض (اللوحة اليسرى ، المنتصف) واضبط إعدادات التعريض الضوئي لتقليل إشارة الخلفية.
      3. انسخ إعدادات التعرض إلى علامة تبويب وضع الصورة باتباع الخطوات 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. انقر فوق رمز النسخ بجوار مربع تحرير خطوة التصوير . انقر فوق تحرير خطوة التصوير ، والتي ستفتح نافذة أخرى.
      5. ضمن قناة GFP، انقر أيقونة الحافظة في خط التعريض الضوئي لإضافة إعدادات الإضاءة ووقت التكامل وكسب الكاميرا إلى القناة.
      6. كرر الخطوات 3.3.3.4-3.3.3.5 لقناة TRITC. انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
4. قم بإعداد خطوات المعالجة المسبقة للصور و Z-projection لأتمتة المعالجة المسبقة للصور.
   1. انقر على أيقونة الكاميرا (اللوحة اليسرى ، الزاوية السفلية). سيتم فتح نافذة جديدة.
   2. ضمن إضافة خطوة معالجة (اللوحة اليسرى ، أسفل) ، انقر فوق المعالجة المسبقة للصور. سيتم فتح نافذة جديدة.
   3. في صفحة الحقل الساطع ، قم بإلغاء تحديد تطبيق المعالجة المسبقة للصور.
   4. لكل علامة تبويب قناة فلورسنت ، تأكد من تحديد تطبيق المعالجة المسبقة للصور . قم بإلغاء تحديد استخدام نفس خيارات القناة 1 وانقر موافق. سيتم إغلاق النافذة.
   5. ضمن إضافة خطوة معالجة ، انقر فوق Z Projection. سيتم فتح نافذة جديدة. إذا رغبت في ذلك ، اضبط نطاق الشريحة (على سبيل المثال ، لتضييق نطاق Z). أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
5. إنشاء بروتوكول.
   1. انقر فوق مجموعة الصور في شريط الأدوات. في القائمة المنسدلة، انقر على إنشاء تجربة من مجموعة الصور هذه. سيتم إغلاق نافذة التصوير ، وسيتم فتح نافذة الإجراء .
      ملاحظة: سيتم تحميل المعلمات المحددة في وضع التصوير اليدوي تلقائيا في النافذة الجديدة، حيث يمكن إنشاء بروتوكول تجريبي.
   2. ضبط درجة الحرارة والتدرج: انقر على ضبط درجة الحرارة أسفل عنوان الإجراءات (يسار). سيتم فتح نافذة جديدة. حدد تشغيل الحاضنة وأدخل درجة الحرارة المطلوبة يدويا ضمن درجة الحرارة. بعد ذلك ، ضمن التدرج ، أدخل 1 يدويا. أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
      ملاحظة: سيؤدي إنشاء تدرج 1 درجة مئوية إلى منع التكثيف من التكون على غطاء اللوحة.
   3. تعيين الآبار للصورة.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق خطوة الصورة ضمن الوصف. انقر فوق لوحة كاملة (الزاوية اليمنى ، أعلى). سيؤدي هذا إلى فتح نافذة تخطيط اللوحة .
      2. تسليط الضوء على الآبار ذات الأهمية باستخدام المؤشر. انقر فوق موافق. إذا رغبت في ذلك، حدد مربعات تجميع التركيز البؤري التلقائي وتجميع الالتقاطات . انقر فوق موافق لإغلاق النافذة.
         ملاحظة: سيتطلب Binning تعديل التعرض، كما هو موضح في الخطوة 3.3.3.2 أعلاه. يرجى الرجوع إلى قسم المناقشة لمعرفة سيناريوهات محددة يمكن استخدام هذه الميزة فيها.
   4. تعيين فترات للتصوير الحركي.
      1. انقر فوق خيارات تحت عنوان أخرى (يسار). حدد مربع الإجراء الحركي المتقطع .
      2. ضمن الوقت الإجمالي المقدر، أدخل وقت التشغيل للتجربة (على سبيل المثال، 5 أيام). ضمن الفاصل الزمني المقدر، أدخل الفاصل الزمني لتصوير اللوحة (على سبيل المثال، كل 6 ساعات).
      3. انقر فوق إيقاف مؤقت بعد كل تشغيل لإتاحة الوقت لنقل اللوحة إلى الحاضنة. أغلق النافذة عن طريق تحديد موافق.
   5. تحديث خطوات تقليل البيانات.
      1. انقر فوق موافق لإغلاق إطار الإجراء. سيتم فتح علامة تبويب لتحديث خطوات تقليل البيانات. حدد نعم. انقر نقرا مزدوجا فوق المعالجة المسبقة للصور. انقر فوق القنوات المختلفة للتحقق من الإعدادات وانقر فوق موافق.
      2. انقر نقرا مزدوجا فوق Z Projection. انقر فوق القنوات المختلفة للتحقق من الإعدادات. انقر فوق موافق. ثم ، انقر فوق "موافق " مرة أخرى لإغلاق نافذة تقليل البيانات.
   6. قم بتنسيق تخطيط اللوحة.
      1. افتح معالج تخطيط اللوحة وقم بتعيين أنواع الآبار باتباع الخطوات 3.6.2-3.6.3.
      2. انقر فوق رمز تخطيط اللوحة في شريط الأدوات (الزاوية اليسرى ، أعلى) لفتح معالج تخطيط اللوحة.
      3. حدد المربعات بجوار أنواع الآبار المستخدمة في التجربة. ضمن عناصر تحكم الفحص، أدخل عدد أنواع عناصر التحكم المختلفة باستخدام الأسهم. انقر فوق التالي لفتح نافذة التحكم في الفحص #1 .
      4. قم بتعيين ظروف بئر التحكم في الفحص باتباع الخطوات 3.6.5-3.6.8.
      5. في النافذة التحكم في الفحص #1، أدخل تسمية عنصر التحكم في المربع معرف تخطيط اللوحة . إذا رغبت في ذلك ، أدخل الاسم الكامل في المربع المجاور. حدد عدد النسخ المتماثلة لحالة التحكم المعنية باستخدام الأسهم.
      6. في حالة استخدام تركيزات متعددة أو سلسلة تخفيف ضمن عنصر التحكم، انقر فوق تعريف التخفيفات/التركيزات واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد النوع. أدخل قيما لكل تركيز/تخفيف في الجدول.
         ملاحظة: يمكن استخدام الوظيفة التلقائية إذا تغيرت التركيزات بزيادة ثابتة.
      7. حدد علامة التبويب اللون في شريط الأدوات. اختر لون النص المطلوب ولون الخلفية للتحكم في القائمة المنسدلة. انقر فوق التالي.
      8. كرر حسب الضرورة مع عناصر تحكم إضافية.
      9. تعيين ظروف عينة جيدة التالية 3.6.10-3.6.12.
      10. في صفحة نموذج الإعداد ، أدخل بادئة معرف العينة (على سبيل المثال، SPL). حدد عدد النسخ المتماثلة باستخدام الأسهم. في حالة استخدام عينات بتركيزات معالجة مختلفة، حدد التركيزات أو التخفيفات في القائمة المنسدلة النوع . أدخل التخفيفات/التركيزات في الجدول وأدخل الوحدات في مربع الوحدة .
      11. حدد حقول التعريف في شريط الأدوات. أدخل اسم (أسماء) الفئة المطلوبة (على سبيل المثال، معرف العينة، الدواء) في الجدول.
      12. حدد علامة التبويب اللون في شريط الأدوات. حدد لونا مختلفا لكل مجموعة / عينة علاجية. انقر فوق إنهاء. سيؤدي هذا إلى فتح صفحة تخطيط اللوحة.
          ملاحظة: ترتبط الأرقام الموجودة على الجانب الأيسر بأرقام العينات المختلفة.
      13. قم بتعيين معرفات نموذجية باتباع الخطوات من 3.6.14 إلى 3.6.16.
      14. اختار SPL1 من اللوحة اليسرى. استخدم المؤشر لتحديد الآبار.
          ملاحظة: يمكن ضبط أدوات التحديد التلقائي في مربع التعيين التسلسلي. يمكن تحديد عدد النسخ المتماثلة واتجاه التخطيط مسبقا.
      15. كرر مع عينات أخرى لإكمال تخطيط اللوحة. بمجرد الرضا ، انقر فوق موافق.
      16. في شريط أدوات الملف ، حدد معرفات العينات. املأ أعمدة معرف العينة بالمعلومات المناسبة لكل عينة (على سبيل المثال، نوع الدواء). اضغط على موافق.
   7. احفظ البروتوكول.
      1. في شريط الأدوات، انقر فوق ملف > حفظ البروتوكول باسم. حدد الموقع لحفظ الملف. أدخل اسم ملف. انقر فوق حفظ لإغلاق النافذة.
      2. انقر فوق ملف > إنهاء في شريط الأدوات. سيتم فتح علامة تبويب لحفظ التغييرات في وضع التصوير اليدوي. حدد لا.
      3. سيتم فتح علامة تبويب لحفظ التغييرات في التجربة 1. حدد لا. سيتم فتح علامة تبويب لتحديث تعريف البروتوكول. حدد تحديث. أغلق البرنامج.
6. قم باستيراد البروتوكول إلى BioSpa OnDemand وانتهي من إعداد التجربة.
   1. افتح برنامج BioSpa OnDemand (برنامج الجدولة).
   2. حدد فتحة متاحة في البرنامج.
   3. قم بإزالة اللوحة من نظام التصوير بالخلايا الحية. انقر فوق فتح الدرج للوصول إلى الفتحة المناسبة في برنامج الجدولة وأدخل اللوحة. انقر فوق إغلاق الدرج.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة في أي وقت بمجرد إنشاء البروتوكول في الخطوة 3.5.7 أعلاه. ومع ذلك ، يجب أن تكون اللوحة في Cytation 5 لإجراء تشغيل توقيت في الخطوة 3.6.4.3 أدناه.
   4. استيراد البروتوكول.
      1. ضمن علامة التبويب معلومات الإجراء ، حدد المستخدم في القائمة المنسدلة. بجوار فتحة البروتوكول ، انقر فوق تحديد > إضافة إدخال جديد.
      2. بجوار فتحة البروتوكول، انقر على تحديد. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة للانتقال إلى البروتوكول المطلوب في بنية الملف. انقر فوق فتح لاستيراد البروتوكول إلى برنامج الجدولة.
      3. أدخل مقدار الوقت اللازم لتصوير اللوحة. انقر فوق موافق لإغلاق نافذة قائمة بروتوكولات Gen5 .
         ملاحظة: هذه الخطوة مهمة بشكل خاص عند تشغيل عدة تجارب في وقت واحد. لتحديد الوقت اللازم لتصوير الصورة، انقر فوق تنفيذ توقيت التشغيل الآن. انقر فوق موافق.
   5. تعيين فترات التصوير وجدولة التجربة.
      1. ضمن الفاصل الزمني، أدخل الفاصل الزمني للتصوير المحدد في الخطوة 3.5.4.
      2. ضمن خيارات وقت البدء، حدد عند توفرها. ضمن المدة، حدد ثابت أو مستمر.
         ملاحظة: يمكن تعيين وقت بدء محدد بدلا من تشغيل البروتوكول في الوقت المتاح التالي. سيؤدي تحديد المدة الثابتة إلى تعيين نقطة نهاية محددة للتجربة ويتطلب من المستخدم تعيين إطار زمني تجريبي. ستسمح المدة المستمرة بتشغيل التجربة بدون نقطة نهاية ولا يمكن إنهاؤها إلا من قبل المستخدم الذي يوقف التجربة.
      3. انقر فوق جدولة اللوحة / السفينة. سيؤدي هذا إلى فتح تسلسل التحقق من صحة اللوحة. سيتم فتح علامة تبويب مع وقت القراءة الأول المقترح. انقر فوق نعم لقبول هذا الجدول.

4. تحليل الصور في برنامج Gen5 (الشكل 2)

1. افتح وحدة تحليل الصور.
   1. افتح Gen5. في إدارة المهام، حدد التجارب > فتح. حدد التجربة لفتح الملف. انقر فوق عرض اللوحة > في شريط الأدوات.
   2. تغيير القائمة المنسدلة البيانات إلى Z Projection. انقر نقرا مزدوجا فوق بئر الاهتمام. حدد تحليل > أريد إعداد خطوة جديدة لتقليل بيانات تحليل الصور. انقر فوق موافق.
2. التحليل الخلوي
   1. قناع أساسي
      1. ضمن إعدادات التحليل، حدد النوع: التحليل الخلوي وقناة الكشف: ZProj[Tsf[حقل ساطع]] (اللوحة اليمنى، في الوسط).
      2. انقر فوق خيارات. سيؤدي هذا إلى فتح صفحة القناع الأساسي والعدد . في المربع العتبة ، حدد تلقائي وانقر فوق تطبيق. انقر مربع إبراز الكائنات (اللوحة اليمنى، أسفل) لإظهار الكائنات ضمن الحد المعين. اضبط حسب الضرورة لتضمين الأشياء ذات الأهمية.
         ملاحظة: تعتمد إعدادات العتبة على كثافة البكسل. على سبيل المثال ، إذا تم تعيين الحد إلى 5000 ، تضمين وحدات البكسل ذات الكثافة الأكبر من 5000 في التحليل.
      3. ضمن تحديد الكائن، قم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم الكائن (μm). اضبط حسب الضرورة لاستبعاد الحطام الخلوي / الخلايا المفردة.
         ملاحظة: قد يختلف حجم شركة تنمية نفط عمان اختلافا كبيرا بين الطرز والأنواع المختلفة. استخدم أداة القياس في برنامج Gen5 لتحديد الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم PDO لكل طراز. يمكن للمستخدمين اختيار حد أدنى أصغر لحجم PDO بالنسبة للقيمة التي توفرها أداة القياس من أجل منع استبعاد شظايا PDO في نقاط زمنية لاحقة بعد العلاج بالعقاقير.
      4. لقصر التحليل على منطقة معينة من البئر، قم بإلغاء تحديد تحليل الصورة بأكملها وانقر توصيل. في نافذة Image Plug ، استخدم القائمة المنسدلة لتحديد شكل التوصيل . اضبط معلمات الحجم والموضع حسب الضرورة لتناسب منطقة الاهتمام.
         ملاحظة: من المهم زيادة عدد PDOs داخل القابس مع استبعاد المناطق الخالية من PDO لتقليل الخلفية. قم بتعيين حجم قابس يلتقط باستمرار غالبية الكائنات ذات الأهمية عبر النسخ المتماثلة. يعد إنشاء قابس يستبعد أيضا حواف القبة أمرا مهما لأنه يستبعد أي كائنات قد تبدو مشوهة بسبب انكسار الضوء من الانحناء الشديد للقبة حول الحواف. تضمين كائنات الحافة الأساسية يمكن أيضا إلغاء تحديدها لالتقاط PDOs بالكامل فقط داخل القابس.
   2. تحليل السكان الفرعي. ويرد مثال على تعيين السكان الفرعيين في الشكل 3.
      1. انقر فوق المقاييس المحسوبة في شريط أدوات التحليل الخلوي . انقر على تحديد أو إنشاء مقاييس الاهتمام على مستوى الكائن (الزاوية اليسرى والسفلية). ضمن مقاييس الكائن المتاح ، حدد مقاييس الاهتمام (على سبيل المثال، الدائرية) وانقر فوق الزر إدراج . انقر فوق موافق.
         ملاحظة: سيحدد مورفولوجيا وكثافة كل نموذج من نماذج شركة تنمية نفط عمان أفضل المقاييس ذات الأهمية لتمييز السكان الفرعي.
      2. انقر فوق تحليل السكان الفرعيين في شريط أدوات التحليل الخلوي . انقر على إضافة لإنشاء مجموعة سكانية فرعية جديدة. سيتم فتح نافذة منبثقة.
      3. أدخل اسما للسكان الفرعيين، إذا رغبت في ذلك. ضمن مقاييس الكائن، حدد مقياسا للاهتمام واضغط على إضافة شرط. في نافذة تحرير الشرط ، أدخل معلمات لمقياس الكائن المختار. كرر مع مقاييس إضافية حسب الضرورة.
         ملاحظة: يمكن ضبط المعلمات يدويا أو تعيينها باستخدام أداة البحث. على سبيل المثال ، لاستبعاد الحطام ، يمكن للمستخدمين إضافة المساحة كمقياس كائن وتحديد كائنات أصغر من 800. يتم استخدام الدائرية كمقياس كائن بشكل روتيني ، ويتم تضمين أي كائنات ذات دائرية أكبر من 0.2-0.5 ، اعتمادا على النموذج.
      4. في الجدول أسفل النافذة ، تحقق من النتائج المطلوبة لعرضها. انقر فوق موافق > تطبيق.
      5. لعرض الكائنات داخل المحتوى الفرعي، استخدم القائمة المنسدلة تفاصيل الكائن (اللوحة اليمنى، في الوسط) لتحديد المحتوى الفرعي. سيتم تمييز الكائنات التي تقع ضمن المعلمات في الصورة.
         ملاحظة: لتغيير ألوان التمييز للقناع الأساسي والسكان الفرعي، انقر فوق الإعدادات (اللوحة اليمنى، أسفل).
      6. لضبط معلمات السكان الفرعي، أعد فتح نافذة تحليل السكان الفرعيين من شريط أدوات التحليل الخلوي . حدد المجموعة الفرعية وانقر فوق تحرير. انقر على إضافة خطوة.
         ملاحظة: سيطبق هذا نفس التحليل على جميع الآبار داخل التجربة في جميع النقاط الزمنية. في القائمة المنسدلة في صفحة Matrix ، يمكن تحديد مقاييس مختلفة للعرض الفردي.

5. تصدير البيانات من Gen5 إلى Excel

1. لتخصيص ملف بيانات للتصدير، حدد أيقونة تقرير/تصدير منشئات في شريط الأدوات. في النافذة المنبثقة، انقر فوق تصدير جديد إلى Excel.
2. في صفحة الخصائص في النافذة المنبثقة، حدد النطاق > اللوحة والمحتوى > مخصص. انقر فوق خيار المحتوى في شريط الأدوات. انقر فوق تحرير القالب ، والذي سيفتح برنامج Excel.
3. ضمن جدول البيانات، حدد الوظائف الإضافية > الجدول > بيانات البئر. مرر مؤشر الماوس فوق التحديدات المختلفة للاطلاع على خيارات التصدير. حدد مقياس الاهتمام (على سبيل المثال ، كائن يعني [ZProj [Tsf [TRITC]]]).
   ملاحظة: يمكن إضافة تخطيط اللوحة إلى قالب تحليل جدول البيانات عن طريق تحديد الوظائف الإضافية > ملخص البروتوكول > تخطيط.
4. سيتم فتح نافذة تحرير . في مربع الآبار ، قم بتعيين الآبار للتصدير إما عن طريق معرف البئر أو البئر #. حدد موافق. سيتم تحميل نموذج في ملف جدول البيانات. إغلاق جدول البيانات. يتم حفظ القالب تلقائيا.
5. انقر فوق "موافق " على تصدير جديد إلى Excel نافذة وأغلق نافذة إنشاء التقارير / التصدير .
6. انقر فوق رمز التصدير في شريط أدوات Gen5. حدد المربع بجوار ملف التصدير المطلوب. انقر فوق موافق. سيقوم Gen5 تلقائيا بملء قالب جدول البيانات وفتح الملف في Excel.

6. تحليل البيانات الخارجية

1. افتح ملف التصدير (.xlsx) في Excel.
2. لكل بئر ، قسم كل قيمة فردية على قيمة النقطة الزمنية 0:00 لهذا البئر. سيؤدي هذا إلى تعيين النقطة الزمنية 0 التي تساوي 1 ، وستكون كل قيمة بعد ذلك مرتبطة بالقراءة الأولية.
3. افتح ملفا جديدا في برنامج تحليل البيانات. حدد خيار تخطيط XY .
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام GraphPad Prism (الإصدار 9.5.1).
4. تسميات الإدخال لكل مجموعة بيانات. انسخ والصق النقاط الزمنية والقيم الطبيعية المقابلة لكل مجموعة علاج في جدول Prism. سيتم إنشاء رسم بياني للبيانات تلقائيا ويمكن العثور عليه ضمن الرسوم البيانية.

النتائج

كان هدفنا هو إثبات جدوى استخدام تصوير الخلايا الحية المتعددة لتقييم الاستجابة العلاجية لشركة تنمية نفط عمان. تم إجراء تجارب إثبات المفهوم في نموذجين منفصلين لشركة تنمية نفط عمان لسرطان بطانة الرحم: ONC-10817 و ONC-10811 (انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 لبيانات ONC-10811). تم ر?...

Discussion

أصبحت ثقافات شركة تنمية نفط عمان شائعة بشكل متزايد في نظام النماذج المختبرية نظرا لقدرتها على عكس الاستجابات والسلوكيات الخلوية². تم إحراز تقدم كبير في تقنيات توليد PDO وثقافتها وتوسعها ، ومع ذلك فقد تأخرت طرق تحليل الاستجابات العلاجية. مجموعات الجدوى 3D المتاحة تجاريا هي مقاي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)