تصوير الكالسيوم الحي للطبقات العضوية المعوية البشرية المصابة بالفيروس باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا

Summary

يصف هذا البروتوكول نهجا لإجراء تصوير الكالسيوم في العضويات المعوية البشرية المصابة بالفيروس ويقدم نهجا للتحليل.

Abstract

إشارات الكالسيوم هي منظم متكامل لكل الأنسجة تقريبا. داخل ظهارة الأمعاء ، يشارك الكالسيوم في تنظيم النشاط الإفرازي ، وديناميات الأكتين ، والاستجابات الالتهابية ، وتكاثر الخلايا الجذعية ، والعديد من الوظائف الخلوية الأخرى غير المميزة. على هذا النحو ، يمكن أن يوفر رسم خرائط ديناميكيات إشارات الكالسيوم داخل ظهارة الأمعاء نظرة ثاقبة للعمليات الخلوية الاستتبابية ويكشف النقاب عن استجابات فريدة لمختلف المحفزات. الكائنات العضوية المعوية البشرية (HIOs) هي نموذج عالي الإنتاجية مشتق من الإنسان لدراسة ظهارة الأمعاء ، وبالتالي تمثل نظاما مفيدا للتحقيق في ديناميكيات الكالسيوم. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتحويل HIOs بثبات باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، وإجراء الفحص المجهري الفلوري الحي ، وتحليل بيانات التصوير لتوصيف إشارات الكالسيوم بشكل هادف. كمثال تمثيلي ، تم تحويل HIOs ثلاثية الأبعاد مع فيروس lentivirus للتعبير بثبات عن GCaMP6s ، وهو GECI خلوي أخضر قائم على البروتين الفلوري. ثم تم تشتيت HIOs المصممة هندسيا في تعليق أحادي الخلية وبذرها كطبقة أحادية. بعد التمايز ، أصيبت أحاديات HIO بفيروس الروتا و / أو عولجت بالأدوية المعروفة بتحفيز استجابة الكالسيوم. سمح مجهر التألق الفائق المزود بغرفة تصوير حية مرطبة يتم التحكم في درجة حرارتها بالتصوير طويل الأمد للطبقات الأحادية المصابة أو المعالجة بالأدوية. بعد التصوير ، تم تحليل الصور المكتسبة باستخدام برنامج التحليل المتاح مجانا ، ImageJ. بشكل عام ، ينشئ هذا العمل خط أنابيب قابل للتكيف لتوصيف الإشارات الخلوية في HIOs.

Introduction

الكالسيوم هو رسول ثان محفوظ على نطاق واسع يلعب دورا مهما في تنظيم علم وظائف الأعضاء الخلوية¹. نظرا لشحنته القوية وصغر حجمه وقابليته العالية للذوبان في الظروف الفسيولوجية ، فإن الكالسيوم هو مناور مثالي لتشكل البروتين. هذا يجعل الكالسيوم وسيلة قوية لتحويل الإشارات الكهروكيميائية إلى تعديلات إنزيمية أو نسخية أو ما بعد النسخ. تخلق تدرجات تركيز الكالسيوم الصارمة عبر الشبكة الإندوبلازمية (ER) وأغشية البلازما قوة دافعة عالية تسمح بتغيرات سريعة في تركيز الكالسيوم الخلوي. آليات متعددة ، بما في ذلك كل من التخزين المؤقت والنقل النشط ، تحافظ بإحكام على هذا التدرج. في حين أن هذه الصيانة ضرورية للوظائف الخلوية العادية ، إلا أنها مكلفة للغاية ، مما يجعلها عرض....

Protocol

تم اشتقاق جميع الكائنات العضوية المعوية البشرية (HIOs) المستخدمة في هذا البروتوكول والتجارب التمثيلية من الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها وصيانتها بواسطة مركز تكساس الطبي للأمراض الهضمية المعوية. تم جمع جميع العينات وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية في كلية بايلور للطب.

1. تحضير المواد والكواشف

1. لصيانة المواد العضوية ، اجمع ألواح 24 بئرا المعالجة بزراعة الخلايا ، ومصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) ، والأنابيب المخروطية سعة 15 مل ، والأنابيب المخروطية سعة 1.5 مل.
   1. لتحضير وسائط كاملة بدون عوامل نمو (CMGF-) ، إلى 500 مل من DMEM F12 المتقدم ، أضف 5 مل من 1M HEPES ، 5 مل من 100x مضاد حيوي مضاد حيوي ، 5....

النتائج

يوضح الشكل 1 أ قبة BMM تحتوي على عضويات معوية بشرية ثلاثية الأبعاد تم تحويلها للتعبير بثبات عن GCaMP6s. يوضح الشكل 1B نفس خط العضو المعاد طلاؤه كطبقة أحادية عند 24 و 48 و 72 ساعة بعد البذر. للتحقق من صحة وظيفة GCaMP6s ، تم تصوير الطبقة الأحادية بواسطة المجهر الفلوري كل 2 ثا.......

Discussion

يمكن أن تكون التغيرات في مستويات Ca²⁺ الخلوية سببا ونتيجة للأمراض داخل الظهارة^10،16،17. يمكن أن تؤدي الزيادات في الكالسيوم الخلوي إلى زيادة الإفراز مباشرة عن طريق تنشيط قناة الكلوريد المعتمدة على الكالسيوم TMEM16A^18,19

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254