A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.

Abstract

الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.

Introduction

الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،....

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام

ملاحظة: التركيزات المذكورة في البروتوكول هي التركيزات النهائية لمكونات الوسائط. قم بإعداد جميع الوسائط في ظروف معقمة في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. استخدم في غضون 2 أسابيع.

  1. وسيط صيانة hPSC: مكمل وسيط صيانة hPSC خال من وحدة التغذية (20 ميكرولتر / مل) مع وسطه الأساسي.
  2. الوسط أ: أضف البروتين المورفولوجي العظمي 4 (BMP4 ؛ 1 نانوغرام / مل) ، SB431542 (10 ميكرومتر) ، و CHIR99021 (600 نانومتر) إلى وسط قاعدة التمايز.
  3. الوسط B: أضف SB431542 (10 μM) و CHIR99021 (1.5 μM) إلى وسط قاعدة التمايز.
  4. الوسط C: أضف SB431542 (10 ميكرومتر) و CH....

النتائج

يوفر هذا البروتوكول طريقة لاشتقاق القمة العصبية المعوية والخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا (الشكل 1A-B). يعتمد توليد خلايا عصبية عالية الجودة على خطوة تحريض قمة عصبية معوية فعالة. يمكن تقييم ذلك بصريا عن طريق التحقق من مورفولوجي?.......

Discussion

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ascorbic acidSigma-AldrichA5960
B27 supplement (serum free, minus vitamin A)Gibco12587-010
Basement membrane matrix, GeltrexGibcoA14133-2
BMP4R&D systems314-BP
Cell culture centrifugeEppendorf, model no. 5810R02262501
Cell detachment solution, AccutaseStemcell Technologies07920
CHIR99021Tocris4423
Conical tubesUSA scientific1475-0511, 1500-1211
Differentiation base medium, Essential 6Life TechnologiesA1516401
DMEM/F-12 no glutamineLife Technologies21331020
EDTACorningMT-46034CI
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium KitLife TechnologiesA2858501
FGF2R&D systems233-FB/CF
FibronectinCorning356008
GDNFPeprotech450-10
HemocytometerHausser Scientific1475
Human pluripotent stem cells, H9 ESCWiCellRRID: CVCL_1240
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2Thermo Fisher ScientificHerralcell 150i
Inverted microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
Laminar flow hoodThermo Fisher Scientific1300 series class II, type A2
LamininCultrex3400-010
L-glutamine supplement, GlutagroCorning25-015-CI
MEM NEAAsCorning25-025-CI
Multiwell plates, FalconBD353934, 353075
N-2 SupplementCTSA1370701
Neurobasal MediumLife Technologies21103049
PBS (Ca and Mg free)Life Technologies10010023
Pipette fillerEppendorfZ768715-1EA
Pipette tipsUSA scientific1111-2830
PipettesFisherbrand13-678-11E, 13-678-11F
POSigma-AldrichP3655
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidiibidi81156
RASigma-AldrichR2625
SB431542R&D systems1614
Trypan blue stain, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250-061
Ultra-low attachment platesFisher Scientific07-200-601
Y-27632 dihydrochlorideR&D systems1254

References

  1. Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
  2. Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric dis....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved