A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يوفر اشتقاق سلالات الجهاز العصبي المعوي (ENS) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) مصدرا قابلا للتطوير للخلايا لدراسة تطور ENS والمرض ، واستخدامه في الطب التجديدي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل في المختبر لاشتقاق الخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا.
الجهاز العصبي المعوي البشري ، ENS، هو شبكة كبيرة من أنواع الخلايا الدبقية والعصبية مع تنوع ملحوظ في الناقلات العصبية. يتحكم ENS في حركة الأمعاء وإفراز الإنزيم وامتصاص العناصر الغذائية ويتفاعل مع الجهاز المناعي وميكروبيوم الأمعاء. وبالتالي ، فإن العيوب التنموية والمكتسبة في ENS هي المسؤولة عن العديد من الأمراض البشرية وقد تسهم في أعراض مرض باركنسون. تشكل القيود في أنظمة النماذج الحيوانية والوصول إلى الأنسجة الأولية تحديات تجريبية كبيرة في دراسات ENS. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل للاشتقاق الفعال في المختبر لسلالات ENS من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، hPSC ، باستخدام ظروف ثقافة محددة. يبدأ بروتوكولنا بالتمايز الموجه ل hPSCs إلى خلايا القمة العصبية المعوية في غضون 15 يوما وينتج أنواعا فرعية متنوعة من الخلايا العصبية المعوية الوظيفية في غضون 30 يوما. توفر هذه المنصة موردا قابلا للتطوير للدراسات التنموية ونمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والتطبيقات التجديدية.
الجهاز العصبي المعوي (ENS) هو أكبر مكون للجهاز العصبي المحيطي. يحتوي ENS على أكثر من 400 مليون خلية عصبية تقع داخل الجهاز الهضمي وتتحكم في جميع وظائف القناة الهضمية 1تقريبا. يتطلب الفهم الجزيئي لتطور ووظيفة ENS وعيوبه في اعتلالات الأعصاب المعوية الوصول إلى مصدر موثوق وأصيل للخلايا العصبية المعوية. الوصول إلى الأنسجة الأولية البشرية محدود ، وتفشل النماذج الحيوانية في تلخيص الأنماط الظاهرية الرئيسية للمرض في العديد من اعتلالات الأعصاب المعوية. أثبتت تقنية الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) أنها مفيدة للغاية في توفير مصدر غير محدود لأنواع الخلايا المرغوبة ، خاصة تلك التي يصعب عزلها عن المصادر الأولية2،....
1. إعداد وسائل الإعلام
ملاحظة: التركيزات المذكورة في البروتوكول هي التركيزات النهائية لمكونات الوسائط. قم بإعداد جميع الوسائط في ظروف معقمة في غطاء تدفق رقائقي ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام. استخدم في غضون 2 أسابيع.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لاشتقاق القمة العصبية المعوية والخلايا العصبية المعوية من hPSCs باستخدام ظروف الثقافة المحددة كيميائيا (الشكل 1A-B). يعتمد توليد خلايا عصبية عالية الجودة على خطوة تحريض قمة عصبية معوية فعالة. يمكن تقييم ذلك بصريا عن طريق التحقق من مورفولوجي?.......
يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة قوية في المختبر للحصول على الخلايا العصبية المعوية من hPSCs في غضون 30-40 يوما (الشكل 1E) والدبقية المعوية التي تعبر عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي ، GFAP ، و SOX10 في الثقافات القديمة (> اليوم 55)13،14،.......
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم العمل بمنح من برنامج UCSF للبحوث الطبية الحيوية المتقدمة ومؤسسة ساندلر ، ومنحة March of Dimes رقم 1-FY18-394 و 1DP2NS116769-01 ، وجائزة المبتكر الجديد لمدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2NS116769) إلى FF والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R01DK121169) إلى FF ، HM مدعوم من زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة Larry L. Hillblom ، زمالة NIH T32-DK007418 وبرنامج UCSF لزمالة ما بعد الدكتوراه المستقلة للبحوث الطبية الحيوية.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
EDTA | Corning | MT-46034CI | |
Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
Fibronectin | Corning | 356008 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
SB431542 | R&D systems | 1614 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved