Epon Post تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني

Summary

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

Abstract

المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) هو فحص مجهري شامل يجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري (FM) وسياق البنية الخلوية الفائقة المكتسبة بواسطة المجهر الإلكتروني (EM). CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية ، وعادة ما تعرض البنية التحتية الفائقة التألق للخطر. بالمقارنة مع راتنجات التضمين المحبة للماء الأخرى ، مثل غليسيديل ميثاكريلات أو HM20 أو K4M ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم. في السابق ، أثبتنا أن mEosEM يمكن أن ينجو من تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم وتضمين Epon. باستخدام mEosEM ، حققنا ، لأول مرة ، Epon post تضمين CLEM ، الذي يحافظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هنا ، نقدم تفاصيل خطوة بخطوة حول إعداد عينة EM ، وتصوير FM ، والتصوير EM ، ومحاذاة الصورة. نقوم أيضا بتحسين إجراءات تحديد نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة تصوير FM أثناء التصوير الكهرومغناطيسي وتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. نعتقد أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق Epon بعد تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باتباع هذا البروتوكول الجديد في مرافق EM التقليدية.

Introduction

يمكن استخدام المجهر الفلوري (FM) للحصول على توطين وتوزيع البروتين المستهدف. ومع ذلك ، يتم فقدان السياق الذي يحيط بالبروتين المستهدف ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في البروتين المستهدف بدقة. يتمتع المجهر الإلكتروني (EM) بأعلى دقة تصوير ، حيث يوفر العديد من التفاصيل تحت الخلوية. ومع ذلك ، تفتقر EM إلى وضع العلامات المستهدفة. من خلال الدمج الدقيق للصورة الفلورية التي التقطتها FM مع الصورة الرمادية التي حصلت عليها EM ، يمكن للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) الجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال وضعيتي التصوير^{هذين 1،2،3،4}.

<....

Protocol

تمت الموافقة على تربية والتجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في المركز الطبي بجامعة فوجيان الطبية. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.

1. إعداد العينة

1. دماغ الفأر
   1. شراء الفئران المعدلة وراثيا (انظر جدول المواد) وبادئات قليل النوكليوتيد (انظر جدول المواد) للنمط الوراثي لهذه الفئران.
   2. قم بإخراج وإزالة الدماغ السليم من قبو الجمجمة باتباع البروتوكول^{المنشور مسبقا 12,13}.
   3. ثبت دماغ الفأر باستخدام 10 مل من المحلول المثبت (انظر جدول المواد<....

النتائج

أظهرت التقارير السابقة أن mScarlet يمكن أن يستهدف الليزوزوم¹⁵. في هذا البروتوكول ، تم حقن AAV المعرب عن mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) في M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) من دماغ الفأر Vglut2-ires-cre باستخدام أدوات مجسمة. باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تظهر الصورة النهائية المرتبطة في الشكل 4 ?.......

Discussion

البروتوكول المقدم هنا هو طريقة تصوير متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات توطين البروتين المستهدف من المجهر الضوئي (LM) والسياق المحيط بالبروتين المستهدف من المجهر الإلكتروني (EM) ⁶. مع قيود البروتينات الفلورية الحالية ، فإن الطريقة المستخدمة على نطاق واسع هي الت.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical