A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا مفصلا لفحص Epon بعد التضمين للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باستخدام بروتين فلوري يسمى mScarlet. يمكن لهذه الطريقة الحفاظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هذه التقنية قابلة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية.

Abstract

المجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM) هو فحص مجهري شامل يجمع بين معلومات التوطين التي يوفرها المجهر الفلوري (FM) وسياق البنية الخلوية الفائقة المكتسبة بواسطة المجهر الإلكتروني (EM). CLEM هو مفاضلة بين التألق والبنية التحتية ، وعادة ما تعرض البنية التحتية الفائقة التألق للخطر. بالمقارنة مع راتنجات التضمين المحبة للماء الأخرى ، مثل غليسيديل ميثاكريلات أو HM20 أو K4M ، فإن Epon متفوقة في الحفاظ على البنية التحتية وخصائص التقسيم. في السابق ، أثبتنا أن mEosEM يمكن أن ينجو من تثبيت رابع أكسيد الأوزميوم وتضمين Epon. باستخدام mEosEM ، حققنا ، لأول مرة ، Epon post تضمين CLEM ، الذي يحافظ على التألق والبنية التحتية في وقت واحد. هنا ، نقدم تفاصيل خطوة بخطوة حول إعداد عينة EM ، وتصوير FM ، والتصوير EM ، ومحاذاة الصورة. نقوم أيضا بتحسين إجراءات تحديد نفس الخلية التي تم تصويرها بواسطة تصوير FM أثناء التصوير الكهرومغناطيسي وتفصيل التسجيل بين صور FM و EM. نعتقد أنه يمكن للمرء بسهولة تحقيق Epon بعد تضمين الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني باتباع هذا البروتوكول الجديد في مرافق EM التقليدية.

Introduction

يمكن استخدام المجهر الفلوري (FM) للحصول على توطين وتوزيع البروتين المستهدف. ومع ذلك ، يتم فقدان السياق الذي يحيط بالبروتين المستهدف ، وهو أمر بالغ الأهمية للتحقيق في البروتين المستهدف بدقة. يتمتع المجهر الإلكتروني (EM) بأعلى دقة تصوير ، حيث يوفر العديد من التفاصيل تحت الخلوية. ومع ذلك ، تفتقر EM إلى وضع العلامات المستهدفة. من خلال الدمج الدقيق للصورة الفلورية التي التقطتها FM مع الصورة الرمادية التي حصلت عليها EM ، يمكن للضوء المترابط والمجهر الإلكتروني (CLEM) الجمع بين المعلومات التي تم الحصول عليها من خلال وضعيتي التصويرهذين 1،2،3،4.

<....

Protocol

تمت الموافقة على تربية والتجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في المركز الطبي بجامعة فوجيان الطبية. يظهر سير العمل خطوة بخطوة للبروتوكول الحالي في الشكل 1.

1. إعداد العينة

  1. دماغ الفأر
    1. شراء الفئران المعدلة وراثيا (انظر جدول المواد) وبادئات قليل النوكليوتيد (انظر جدول المواد) للنمط الوراثي لهذه الفئران.
    2. قم بإخراج وإزالة الدماغ السليم من قبو الجمجمة باتباع البروتوكولالمنشور مسبقا 12,13.
    3. ثبت دماغ الفأر باستخدام 10 مل من المحلول المثبت (انظر جدول المواد<....

النتائج

أظهرت التقارير السابقة أن mScarlet يمكن أن يستهدف الليزوزوم15. في هذا البروتوكول ، تم حقن AAV المعرب عن mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) في M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) من دماغ الفأر Vglut2-ires-cre باستخدام أدوات مجسمة. باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، تظهر الصورة النهائية المرتبطة في الشكل 4 ?.......

Discussion

البروتوكول المقدم هنا هو طريقة تصوير متعددة الاستخدامات ، والتي يمكن أن تجمع بين معلومات توطين البروتين المستهدف من المجهر الضوئي (LM) والسياق المحيط بالبروتين المستهدف من المجهر الإلكتروني (EM) 6. مع قيود البروتينات الفلورية الحالية ، فإن الطريقة المستخدمة على نطاق واسع هي الت.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32201235 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة فوجيان ، الصين (2022J01287 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في جامعة فوجيان الطبية ، الصين (XRCZX2021013 إلى Zhifei Fu) ، ومؤسسة العلوم المالية الخاصة بمقاطعة فوجيان ، الصين (22SCZZX002 إلى Zhifei Fu) ، تأسيس مختبر NHC الرئيسي للتقييم الفني لتنظيم الخصوبة للرئيسيات غير البشرية ، ومستشفى فوجيان لصحة الأمومة والطفل (2022-NHP-04 إلى Zhifei Fu). نشكر Linying Zhou و Minxia Wu و Xi Lin و Yan Hu في مركز خدمة التكنولوجيا العامة بجامعة فوجيان الطبية على الدعم في إعداد عينات EM والتصوير الكهرومغناطيسي.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)Shanghai yuanye Bio-TechnologyR26284
25% Glutaraldehyde (GA)Alfa AesarA17876Hazardous chemical
Abbelight 3DNanolnsights
AcetoneSCR10000418
Ammonium hydroxideJ&K Scientific335213
BioPhotometer D30eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
CoverglassWarner64-0715
DABCO Sigma290734Hazardous chemical
DDSASPI companyGS02827Hazardous chemical
Desktop centrifugeWIGGENSMINICEN 10E
Diamond knifeDiATOMEMX6353
DMP-30SPI companyGS02823Hazardous chemical
DNA transfection reagentThermo Fisher 2696953Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812 SPI companyGS02659Hazardous chemical
EthanolSCR10009218
Fiji image JNational Institutes of Health
Fixative solution 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
FormvarSigma9823
GlycerolSCR10010618
Gold nanoparticlesCorpuscular790120-010
Gradient resinAcetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acidSCR10011118
Hydrogen peroxideSCR10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamberThermo Fisher A7816
Large gelatin capsulesElectron Microscopy Sciences70117
Mounting bufferMowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88Sigma9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2OSCR10020318
NaH2PO4 ž2H2OSCR20040718
NMASPI companyGS02828Hazardous chemical
Oligonucleotide primersTakara Biomedical Technology (Beijing)Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtomeLeicaVT1000S
Osmium tetroxideSCRL01210302Hazardous chemical
OsO4 solution1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
ParafilmAmcorPM-996
Paraformaldehyde (PFA)SCR80096618Hazardous chemical
Perfusion buffer4% PFA+0.1 M PB
PioloformSigma63148-65-2Hazardous chemical
Poly-L-lysine Sigma25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) SCR10016818
Scalpel bladesMerckS2771
Scalpel handlesMerckS2896-1EA
StereomicroscopeOLYMPUSMVX10
Transgenic miceThe Jackson LaboratoryVglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.  
Transmission electron microscope (TEM)FEITECNAL G2
UA solution (2% UA)Aqueous solution
UltramicrotomeLeicaLEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)TED PELLA19481Hazardous chemical

References

  1. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
  2. Kopek, B. G., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved