إنتاج مصفوفة القلب خارج الخلية من الخلايا الليفية البشرية البالغة لطلاء طبق الثقافة

Summary

تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من قلب الإنسان البالغ لتلتقي على الأطباق المغلفة بالجيلاتين لإنتاج مصفوفة خارج الخلية خاصة بعضلة القلب. بعد إزالة الخلايا ، يمكن استخدام هذه الركيزة لزراعة ودراسة الخلايا القلبية الأخرى وتفاعلات مصفوفة الخلايا.

Abstract

تتكون عضلة القلب من خلايا عضلية قلبية وعدد أكبر من الخلايا الليفية ، والأخيرة مسؤولة عن إنتاج المصفوفة خارج الخلية. من المراحل المبكرة لتطور القلب طوال العمر ، في كل من الظروف الطبيعية والمرضية ، يتغير تكوين المصفوفة خارج الخلية ويؤثر على بنية عضلة القلب ووظيفتها. الغرض من الطريقة الموصوفة هنا هو الحصول على الركيزة لثقافة خلايا القلب في المختبر (تسمى ECM القلبية) ، ومحاكاة مصفوفة عضلة القلب خارج الخلية في الجسم الحي. تحقيقا لهذه الغاية ، تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من قلب الإنسان البالغ لالتقاء الأطباق المغلفة بالجيلاتين لإنتاج مصفوفة خارج الخلية خاصة بعضلة القلب. أنتجت الإزالة اللاحقة للخلايا الليفية القلبية ، مع الحفاظ على ECM القلبي المترسب ، الركيزة لدراسة تأثير المصفوفة خارج الخلية الخاصة بعضلة القلب على الخلايا الأخرى. الأهم من ذلك ، أن تكوين الطلاء المشتق من الخلايا الليفية لطبق الثقافة يتغير وفقا للنشاط في الجسم الحي للخلايا الليفية المعزولة من القلب ، مما يسمح بإجراء دراسات لاحقة لتفاعلات مصفوفة الخلايا في ظروف طبيعية ومرضية مختلفة.

Introduction

توجد جميع الخلايا في الجسم الحي في بيئة دقيقة متخصصة يمكنها من خلالها البقاء على قيد الحياة والقيام بوظائفها المحددة. داخل أي نسيج معين ، تحاط الخلايا بمصفوفة خارج الخلية تتكون من بروتينات ليفية وغير ليفية ، ومواد أساسية غنية بالجليكوزامينوجليكان¹. تؤثر التغيرات النوعية والكمية في محتوى المصفوفة على بيولوجيا الخلية ، والتحكم في عمليات مثل تكاثر الخلايا أو موت الخلايا المبرمج أو الهجرة أو التمايز. ومن ثم ، يتم استثمار الجهود في إعادة إنشاء هذه البيئة المكروية للدراسات المختبرية للخلايا من الأنسجة المختلفة ^2,3.

Protocol

تم الحصول على أنسجة القلب من المرضى الذين يعانون من قصور القلب في المرحلة النهائية بسبب اعتلال القلب الإقفاري الذين كانوا يخضعون لعملية زرع القلب. تم جمع جميع العينات المستخدمة في التجارب بموافقة المريض وبدون معرفات المريض ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة نابولي فيديريكو الثاني ووفقا للمبادئ الموضحة في إعلان هلسنكي. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. إعداد التجربة

1. تحضير أدوات / أجهزة معقمة: زوج كبير من المقصات الجراحية ، ومجموعتان من الملقط الدقيق ، وزوجان من مقص التشريح الدقيق ، وزجاجة معقمة سعة 1 ....

النتائج

لوحظ نمو الخلايا الليفية من شظايا صغيرة من عضلة القلب الأصلية الموضوعة في الثقافة في غضون 3-5 أيام (الشكل 1).

في الأيام اللاحقة ، استمر عدد الخلايا الليفية في الزيادة ، ربما بسبب النمو المستمر من عينة أنسجة القلب وانتشار الخلايا الليفية المه?.......

Discussion

تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من عينات قلب الإنسان إلى التقاء، لمدة 21 يوما لتجميع وإيداع المصفوفة خارج الخلية، لتشكيل طبقة متماسكة ملتصقة بقوة بسطح صفيحة الاستزراع. أنتجت الإزالة اللاحقة للخلايا الليفية القلبية ، مع الحفاظ على ECM القلبي المترسب ، الركيزة لدراسة ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes