إنتاج مصفوفة القلب خارج الخلية من الخلايا الليفية البشرية البالغة لطلاء طبق الثقافة

Summary

تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من قلب الإنسان البالغ لتلتقي على الأطباق المغلفة بالجيلاتين لإنتاج مصفوفة خارج الخلية خاصة بعضلة القلب. بعد إزالة الخلايا ، يمكن استخدام هذه الركيزة لزراعة ودراسة الخلايا القلبية الأخرى وتفاعلات مصفوفة الخلايا.

Abstract

تتكون عضلة القلب من خلايا عضلية قلبية وعدد أكبر من الخلايا الليفية ، والأخيرة مسؤولة عن إنتاج المصفوفة خارج الخلية. من المراحل المبكرة لتطور القلب طوال العمر ، في كل من الظروف الطبيعية والمرضية ، يتغير تكوين المصفوفة خارج الخلية ويؤثر على بنية عضلة القلب ووظيفتها. الغرض من الطريقة الموصوفة هنا هو الحصول على الركيزة لثقافة خلايا القلب في المختبر (تسمى ECM القلبية) ، ومحاكاة مصفوفة عضلة القلب خارج الخلية في الجسم الحي. تحقيقا لهذه الغاية ، تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من قلب الإنسان البالغ لالتقاء الأطباق المغلفة بالجيلاتين لإنتاج مصفوفة خارج الخلية خاصة بعضلة القلب. أنتجت الإزالة اللاحقة للخلايا الليفية القلبية ، مع الحفاظ على ECM القلبي المترسب ، الركيزة لدراسة تأثير المصفوفة خارج الخلية الخاصة بعضلة القلب على الخلايا الأخرى. الأهم من ذلك ، أن تكوين الطلاء المشتق من الخلايا الليفية لطبق الثقافة يتغير وفقا للنشاط في الجسم الحي للخلايا الليفية المعزولة من القلب ، مما يسمح بإجراء دراسات لاحقة لتفاعلات مصفوفة الخلايا في ظروف طبيعية ومرضية مختلفة.

Introduction

توجد جميع الخلايا في الجسم الحي في بيئة دقيقة متخصصة يمكنها من خلالها البقاء على قيد الحياة والقيام بوظائفها المحددة. داخل أي نسيج معين ، تحاط الخلايا بمصفوفة خارج الخلية تتكون من بروتينات ليفية وغير ليفية ، ومواد أساسية غنية بالجليكوزامينوجليكان¹. تؤثر التغيرات النوعية والكمية في محتوى المصفوفة على بيولوجيا الخلية ، والتحكم في عمليات مثل تكاثر الخلايا أو موت الخلايا المبرمج أو الهجرة أو التمايز. ومن ثم ، يتم استثمار الجهود في إعادة إنشاء هذه البيئة المكروية للدراسات المختبرية للخلايا من الأنسجة المختلفة ^2,3.

تتكون عضلة القلب من خلايا عضلة القلب وكمية أكبر من الخلايا الليفية التي تلعب دورا مهما في إنتاج والحفاظ على المصفوفة خارج الخلية داخل عضلة القلب⁴. طوال الحياة ، يمكن أن يتغير تكوين المصفوفة خارج الخلية استجابة لمختلف العوامل الطبيعية والمرضية. هذه التعديلات في تكوين المصفوفة خارج الخلية لها تأثير كبير على البنية والخصائص الميكانيكية الحيوية لعضلة القلب⁵. وفقا لذلك ، يجب أن يكون من المفيد فهم تفاعلات مصفوفة الخلايا داخل عضلة القلب البشرية إذا تم استنساخ البيئة المكروية الخاصة بمختلف الأعمار أو الحالات المرضية في المختبر ^6,7.

تهدف الطريقة الموصوفة هنا إلى الحصول على الركيزة لثقافة خلايا القلب في المختبر (تسمى ECM القلبية) ، والتي تحاكي مصفوفة عضلة القلب خارج الخلية في الجسم الحي.

تقدم أبحاث القلب والأوعية الدموية تحديات محددة ، بما في ذلك صعوبة الحصول على عينات من المتبرعين الأحياء أو المرضى وزراعة خلايا القلب البشرية⁸. تعالج الطريقة المعروضة هنا هذه التحديات من خلال تمكين الحصول على الخلايا الليفية القلبية حتى من شظايا ثنائية البصرية صغيرة من عضلة القلب البشرية وزراعة خلايا القلب المعزولة في المختبر على مصفوفتها الأصلية خارج الخلية النموذجية لعضلة القلب البشرية.

بينما تركز الجهود الحالية على تطوير سقالات 3D من البوليمرات الاصطناعية أو الطبيعية الحيوية التي تحاكي الخصائص الميكانيكية الحيوية لعضلة القلب^{الطبيعية 9} ، فإنها تتجاهل تفاعلات مصفوفة الخلايا والإشارات التي تحدث في كل من الظروف العادية والمرضية. نظرا لأن ECM القلبي يتم تصنيعه بواسطة الخلايا الليفية القلبية المشتقة من قلب الإنسان ، يتم تحديد تكوينه من خلال نشاط هذه الخلايا ، والذي يتغير استجابة لمختلف الحالات الفسيولوجية والمرضية ، مما يسمح بدراسة تأثيره المحدد على بيولوجيا خلايا القلب¹⁰.

تم تصميم البروتوكول الحالي خصيصا لأنسجة القلب البشري ، ولكن يجب أن ينطبق أساسه العلمي أيضا على الأعضاء الأخرى ، خاصة تلك ذات إمكانات التجديد المنخفضة ، والتليف الشديد ، والتندب الذي يؤثر على الهيكل العام والوظيفة ، بالإضافة إلى أعداد وأحجام العينات المحدودة.

Protocol

تم الحصول على أنسجة القلب من المرضى الذين يعانون من قصور القلب في المرحلة النهائية بسبب اعتلال القلب الإقفاري الذين كانوا يخضعون لعملية زرع القلب. تم جمع جميع العينات المستخدمة في التجارب بموافقة المريض وبدون معرفات المريض ، وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل اللجنة الأخلاقية لجامعة نابولي فيديريكو الثاني ووفقا للمبادئ الموضحة في إعلان هلسنكي. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة في جدول المواد.

1. إعداد التجربة

1. تحضير أدوات / أجهزة معقمة: زوج كبير من المقصات الجراحية ، ومجموعتان من الملقط الدقيق ، وزوجان من مقص التشريح الدقيق ، وزجاجة معقمة سعة 1 لتر ، وزجاجة معقمة سعة 500 مل ، وزجاجة معقمة سعة 250 مل.
2. قم بتطهير أكواب الغطاء مقاس 22 مم × 22 مم بنسبة 70٪ من الإيثانول لبضع ثوان. قم بشفط الإيثانول باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، واترك أكواب الغطاء تجف في الفرن عند 37 درجة مئوية ، وقم بتعقيمها في الأوتوكلاف.
3. قم بإذابة الأملاح المسحوقة المتاحة تجاريا في ماء مقطر مزدوج معقم. في زجاجة معقمة سعة 1 لتر ، أضف 0.35 جم من مسحوق بيكربونات الصوديوم لتحضير 1 لتر من محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانك عند درجة الحموضة 7.4. تعقيم المحلول باستخدام أغشية مرشح 0.22 ميكرومتر تحت غطاء معقم وتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
4. تزن 0.1 جم من فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، و 4.0 جم من كلوريد الصوديوم ، و 0.1 جم من كلوريد البوتاسيوم ، و 0.575 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة لتحضير 500 مل من 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بإذابة المكونات في ماء مقطر مزدوج معقم ثم تحقق من قيمة الأس الهيدروجيني (7.4). يعقم تحت غطاء معقم عن طريق الترشيح ويخزن على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
5. أضف 5 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS) إلى 45 مل من HBSS لتحضير حجم نهائي قدره 50 مل من محلول توقف التربسين (TSS). يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
6. قم بقياس 223.75 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل ب 25 مل من FBS (التركيز النهائي ، 10٪) وإضافة 1.25 مل من محلول البنسلين والستربتومايسين (قلم / بكتيريا ، التركيز النهائي ، 0.5٪) لإعداد DMEM لعزل الخلايا الليفية وزرعها. يحفظ على حرارة 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
7. تحضير 0.2٪ (وزن / حجم) محلول الجيلاتين عن طريق إضافة 0.2 غرام من الجيلاتين من مسحوق جلد الخنازير إلى 100 مل من برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: ترد في الجدول 1 المكونات والتركيزات الخاصة بكل محلول مستخدم في الدراسة.

2. الثقافة البدائية للخلايا الليفية القلبية البشرية عن طريق النمو من شظايا عضلة القلب الأذينية

ملاحظات: يجب تنفيذ الخطوات 2.2-2.3 في ظروف معقمة. يتم التحقق من صحة البروتوكول للعينات الأذينية التي يبلغ قطرها حوالي 0.3 سم ، وهو بعد نموذجي لعينات الخزعة ويسمح بعزل ما يقرب من 2 × 10⁶ من الخلايا الليفية.

1. اغسل العينة التي تم الحصول عليها حديثا من الأذين في صفيحة زجاجية مقاس 100 مم مع HBSS معقمة ، مع رجها برفق لإزالة الدم. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات ، وقم بتغيير HBSS واللوحة في كل غسلة.
2. ضع العينة في صفيحة 100 مم مبللة مسبقا بحجم صغير من HBSS واقطعها جيدا باستخدام مشارط متقاطعة إلى حوالي 2 مم مكعبات.
3. ضع أربع شظايا صغيرة من عضلة القلب في صفيحة 35 مم ، قريبة بما يكفي للاستلقاء تقريبا بزاوية غطاء زجاجي 22 مم × 22 مم ، ضع غطاء الزجاج المعقم فوق الشظايا ، واضغط برفق ، وأضف 1.5 مل من DMEM.
4. احتضان لوحات الاستزراع عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ لمدة 15 يوما تقريبا أو حتى تصل الخلايا إلى التقاء 85٪ ، والتحقق يوميا من نمو الخلايا في مجهر تباين الطور المقلوب وتغيير وسط الاستزراع كل 3 أيام.

3. الثقافة الفرعية للخلايا الليفية القلبية البشرية عن طريق التربسين الدافئ

ملاحظات: يجب تنفيذ الخطوات المذكورة أدناه في ظروف معقمة. نظرا لأن الخلايا الليفية يمكن أن تهاجر من الأنسجة المزروعة على طول سطح الغطاء الزجاجي ولوحة الاستزراع ، فمن المستحسن معالجة كليهما للثقافة الفرعية الأولى.

1. ارفع غطاء الزجاج بملقط ناعم ومعقم ، وضعه رأسا على عقب في لوحة جديدة مقاس 35 مم ، واشطفه باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
2. قم بإزالة شظايا عضلة القلب ، وتجاهلها ، وشطف اللوحة مقاس 35 مم بخلايا متضخمة مع برنامج تلفزيوني معقم.
3. تخلص من الشطف وأضف 1 مل من 0.25٪ تربسين-EDTA (حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك) إلى كل طبق. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂. تأكيد انفصال الخلايا في المجهر. يجب تقريب الخلايا بالكامل وفصلها ، وتشكيل كتل صغيرة.
4. منع التربسين عن طريق إضافة 2 مل من TSS إلى كل لوحة 35 مم وجمع التعليق في أنبوب معقم سعة 15 مل ، جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. نضح المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، وأعد تعليق الحبيبات في 3 مل من DMEM وضع تعليق الخلية في لوحة 60 مم.
6. احتضان هذه الخلايا التي تم الحصول عليها في المستزرع الفرعي 1 (أو الممر 1) في 3 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ ، وتغيير الوسط كل ثلاثة أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 75٪.
7. استزراع الخلايا الليفية التي وصلت إلى التقاء 75٪ ، وتكرار التربسين الدافئ وتقسيم الخلايا 1: 3 إلى ألواح جديدة 60 مم حتى مرتين (الممرات 2 و 3).

4. ترسب مصفوفة خارج الخلية

1. تحضير الأطباق المغلفة بالجيلاتين بإضافة 3 مل من محلول الجيلاتين المعقم 0.2٪ لكل صفيحة 60 مم واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ؛ ثم نضح المحلول وإضافة 3 مل من برنامج تلفزيوني معقم حتى الاستخدام.
2. فصل الخلايا الليفية القلبية عن طريق التربسين الدافئ واستزراعها بكثافة عالية (15 × 10³ خلايا لكل سم²) على ألواح مغلفة بالجيلاتين 60 مم.
3. استزرع الخلايا الليفية في حالة التقاء لمدة تصل إلى 21 يوما ، مما يسمح بتوليف المصفوفة خارج الخلية وترسبها. استبدل 50٪ من الوسط بوسط طازج كل 3 أيام.

5. إزالة الخلايا من المصفوفة خارج الخلية

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 5.3-5.4 مع اهتزاز لطيف لإزاحة الخلايا فقط دون فصل المصفوفة خارج الخلية.

1. قم بإعداد محلول إزالة الخلايا يحتوي على 0.25٪ Triton X-100 و 10 mM NH₄OH في PBS (احسب الحجم النهائي ، مع مراعاة 1 مل لكل لوحة 60 مم).
2. قم بإزالة وسط الثقافة وشطف الأطباق باستخدام PBS. تخلص من الشطف.
3. أضف 1 مل من محلول إزالة الخلايا وراقب الألواح في مجهر تباين الطور المقلوب ؛ بعد 1-2 دقيقة ، عندما لا تكون الخلايا قابلة للتمييز ، أضف برفق 4 مل من PBS لتخفيف محلول إزالة الخلايا.
4. قم بإزالة المحلول المخفف وشطف الألواح برفق باستخدام برنامج تلفزيوني ؛ تخلص من الشطف.
5. أضف 1 مل من PBS وقم بتخزين الألواح المطلية ب ECM على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

النتائج

لوحظ نمو الخلايا الليفية من شظايا صغيرة من عضلة القلب الأصلية الموضوعة في الثقافة في غضون 3-5 أيام (الشكل 1).

في الأيام اللاحقة ، استمر عدد الخلايا الليفية في الزيادة ، ربما بسبب النمو المستمر من عينة أنسجة القلب وانتشار الخلايا الليفية المه?...

Discussion

تم استزراع الخلايا الليفية المعزولة من عينات قلب الإنسان إلى التقاء، لمدة 21 يوما لتجميع وإيداع المصفوفة خارج الخلية، لتشكيل طبقة متماسكة ملتصقة بقوة بسطح صفيحة الاستزراع. أنتجت الإزالة اللاحقة للخلايا الليفية القلبية ، مع الحفاظ على ECM القلبي المترسب ، الركيزة لدراسة ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes