JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف علم الأدوية الشبكي وتقنيات الالتحام الجزيئي لاستكشاف آلية عمل Jiawei Shengjiang San (JWSJS) في علاج اعتلال الكلية السكري.

Abstract

كنا نهدف إلى الخوض في الآليات التي يقوم عليها عمل Jiawei Shengjiang San (JWSJS) في علاج اعتلال الكلية السكري ونشر علم الأدوية الشبكي. باستخدام علم الأدوية الشبكي وتقنيات الالتحام الجزيئي ، توقعنا المكونات والأهداف النشطة ل JWSJS وأنشأنا شبكة "هدف مكون الدواء" الدقيقة. تم استخدام تحليلات إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) لتمييز المسارات العلاجية وأهداف JWSJS. تم نشر Autodock Vina 1.2.0 للتحقق من الالتحام الجزيئي ، وتم إجراء محاكاة ديناميكيات جزيئية 100 نانوثانية لتأكيد نتائج الالتحام ، تليها التحقق من في الجسم الحي . كشفت النتائج أن JWSJS تشترك في 227 هدفا متقاطعا مع اعتلال الكلية السكري ، مما أدى إلى بناء طوبولوجيا شبكة تفاعل البروتين والبروتين. يشير تحليل التخصيب KEGG إلى أن JWSJS يخفف من اعتلال الكلية السكري عن طريق تعديل الدهون وتصلب الشرايين ، ومسار إشارات PI3K-Akt ، وموت الخلايا المبرمج ، ومسار إشارات HIF-1 ، مع بروتين كيناز المنشط للميتوجين 1 (MAPK1) ، MAPK3 ، مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) ، وكيناز بروتين سيرين / ثريونين 1 (AKT1) تم تحديدها كأهداف جماعية لمسارات متعددة. أكد الالتحام الجزيئي أن المكونات الأساسية ل JWSJS (كيرسيتين وحمض بالميتوليك ولوتولين) يمكن أن تثبت التشكل مع ثلاثة أهداف محورية (MAPK1 و MAPK3 و EGFR) من خلال الترابط الهيدروجيني. أشارت الفحوصات في الجسم الحي إلى زيادة ملحوظة في وزن الجسم وانخفاض في بروتين المصل السكري (GSP) ، وكوليسترول البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL-C) ، ويوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP) ، ومستويات الجلوكوز في الدم الصائم (FBG) بسبب JWSJS. سلط المجهر الإلكتروني إلى جانب الهيماتوكسيلين والإيوزين (HE) وتلطيخ حمض شيف الدوري (PAS) الضوء على إمكانات كل مجموعة علاجية في التخفيف من تلف الكلى بدرجات متفاوتة ، مما يدل على انخفاضات متنوعة في p-EGFR و p-MAPK3 / 1 و BAX ، وزيادات في تعبير BCL-2 في أنسجة الكلى للفئران المعالجة. بشكل قاطع ، تشير هذه الأفكار إلى أن الفعالية الوقائية ل JWSJS على اعتلال الكلية السكري قد تترافق مع قمع تنشيط مسار إشارات EGFR / MAPK3 / 1 وتخفيف موت الخلايا المبرمج للخلايا الكلوية.

Introduction

داء السكري (DM) هو مرض مزمن يؤثر على أنظمة متعددة ويمكن أن يسبب مضاعفات مختلفة بسبب ارتفاع السكر في الدم المستمر ، مثل اعتلال الكلية السكري (DN) واعتلال الشبكية والاعتلال العصبي1. DN هو أحد المضاعفات الخطيرة لمرض الكلى DM ، وهو ما يمثل حوالي 30٪ -50٪ من مرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD) 2. مظاهره السريرية هي بيلة الزلال الدقيقة ، والتي يمكن أن تتطور إلى ESRD تتميز بزيادة الحجم الكبيبي ، تضخم اللحمة الوسيطة ، والغشاء القاعدي الكبيبيالسميك 3. التسبب في DN معقد ولم يتم توضيحه بالكامل. تستخدم الطرق السريرية مثل خفض نسبة الجلوكوز في الدم ، وتنظيم ضغط الدم ، وتقليل البيلة البروتينية في الغالب لتأخير تقدمها ، ولكن التأثير عام.

حاليا ، لم يتم العثور على دواء محدد لعلاج DN4. لعدة قرون ، ومع ذلك ، فقد استخدمت الأدوية العشبية الصينية على نطاق واسع في علاج DM ومضاعفاته5 وحسنت الأعراض السريرية للمرضى وتأخر تطور المرض. نظرا لمزايا التأثيرات متعددة المكونات والأهداف ومتعددة المسارات ، من المتوقع أن تكون الأدوية العشبية الصينية مصدرا دوائيا مبتكرا لعلاج DN6.

نشأت "Shengjiang san" من "Wanbing Huichun" من قبل الطبيب الطبي في عهد أسرة مينغ غونغ تينغ شيان. يصف كتاب "Neifu Xianfang" استخدام Bombyx Batryticatus و Cicadae Periostracum و Curcumaelongae Rhizoma و Radix Rhei et Rhizome. بناء على ذلك ، بعد إضافة Hedysarum Multijugum Maxim و Epimrdii Herba و Smilacis Glabrae Rhixoma ، فإنه يمارس وظيفة shengjiang san المتمثلة في زيادة الوضوح وتقليل التعكر وإطلاق "الحرارة" الراكدة وتنسيق "qi" والدم 7,8. كما أنه يزيد من تأثير تقوية الطحال وتنغيم الكلى. تتوافق فعاليته مع التسبب في "تشي" DN في الارتفاع والانخفاض بسبب نقص "الطاقة الحيوية" والجفاف المفرط و "الحرارة" وركود "الحرارة" الناجم عن إنرجايزرثلاثي 7,8.

أظهرت الدراسات السريرية السابقة أن الأدوية العشبية الصينية قد استخدمت لعلاج DM ومضاعفاته ، وقد ثبت أن jiawei shengjiang san (JWSJS) ينظم نسبة الجلوكوز في الدم والدهون ، ويقلل من البيلة البروتينية ، ويحسن بشكل كبير الفعالية السريرية للمرضى الذين يعانون من DN7 المبكر. تم تأكيد قدرة JWSJS على تقليل مستويات البروتين البولي والجلوكوز في الدم في فئران DN من خلال الدراسات السابقة. يحدث هذا على الأرجح عن طريق تثبيط مسارات إشارات TXNIP / NLRP3 و RIP1 / RIP3 / MLKL ، والحد من داء بيروبتوسيس podocyte ، ومنع موت الخلايا المبرمج الناخر في الأنسجة الكلوية للفئران DN ، وبالتالي تحقيق الحماية الكلوية9. يمكن ل JWSJS تنظيم تعبير بروتين النيفرين والبودوسين وتقليل إصابة الخلايا البدوية في فئران DN ، مما يشير إلى أن JWSJS له تأثير مثبط على إصابة podocyte. JWSJS له تأثير معين مضاد ل DN مع ملفات تعريف أمان جيدة ، ولكن هناك القليل من الأبحاث حوله ، ويركز هذا العمل في الغالب على pyroptosis وموت الخلايا المبرمج النخرية. الأدبيات ليست عميقة أو منهجية بما فيه الكفاية10. أكدت النتائج السابقة التي توصلنا إليها أن JWSJS يمكن أن تقلل من البيلة البروتينية وتخفف من تلف الكلى في فئران DN7. ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الدراسات حول آلية JWSJS لعلاج DN ، وهذه تفتقر إلى العمق والتنظيم. وبالتالي ، تهدف هذه الدراسة إلى تحليل المواد الجزيئية وآليات عمل JWSJS لعلاج DN باستخدام علم الأدوية الشبكي وتوفير أساس متين للبحث في المستقبل.

علم الأدوية الشبكي هو طريقة ناشئة لدراسة آلية عمل الدواء ، بما في ذلك المعلوماتية الكيميائية ، وبيولوجيا الشبكة ، والمعلوماتية الحيوية ، وعلم الأدوية11،12. يشبه تصميم أبحاث علم الصيدلة الشبكي إلى حد كبير المفهوم الشامل للطب الصيني التقليدي13,14 ، وهو طريقة مهمة لدراسة آلية الأدوية العشبية الصينية. يمكن للالتحام الجزيئي دراسة التفاعلات بين الجزيئات والتنبؤ بأنماط ارتباطها وتقاربها. برز الالتحام الجزيئي كتقنية حاسمة في مجال أبحاث الأدوية بمساعدة الكمبيوتر15. لذلك ، قامت هذه الدراسة ببناء شبكة تفاعل JWSJS-DN المستهدفة من خلال علم الأدوية الشبكي وطرق الالتحام الجزيئي التي توفر أساسا موثوقا ونظريا لمزيد من الاستكشاف لمعالجة DN باستخدام JWSJS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحفاظ على جميع واستخدامها وفقا لدليل المجلس القومي للبحوث الأمريكي لرعاية واستخدام المختبر ، الإصدار الثامن ، وتم الإبلاغ عنها على النحو الموصى به في إرشادات REACH16،17. أجريت الدراسة وفقا لدليل المجلس القومي الصيني للبحوث لرعاية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات بجامعة خبي للطب الصيني (DWLL2019030).

1. المكونات النشطة JWSJS والمجموعة المستهدفة

  1. أدخل التركيب الطبي JWSJS (Hedysarum multijugum Maxim و Epimrdii Herba و Smilacis Glabrae Rhixoma و Radix Rhei et Rhizome و Curcumaelongae Rhizoma) في قاعدة بيانات علم الأدوية لأنظمة الطب الصيني التقليدية ومنصة التحليل (TCMSP)قاعدة البيانات 18 لاسترداد جميع المكونات الكيميائية.  وفقا للامتصاص والتوزيع والتمثيل الغذائي والإفراز (ADME) فحص التوافر البيولوجي عن طريق الفم (OB) ≥ 30٪ والخصائص الشبيهة بالأدوية (DL) ≥ 0.18 المكونات الكيميائية19,20.
  2. استخدم قاعدة بيانات TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php ، الإصدار 2.3) لاسترداد الأهداف المقابلة للمكونات الكيميائية.
  3. احصل على المكونات النشطة ل Bombyx Batryticatus و Cicadae Periostracum من خلال البحث في قواعد بيانات الطب الصيني التقليدي والتركيب الكيميائي21.
  4. من أجل المصداقية التجريبية ، حدد المركبات ذات أرقام خدمة المستخلصات الكيميائية (CAS) لهذه الدراسة. ثم قم بتنزيل مخططات بنية ثنائية الأبعاد (تنسيق .sdf) للمكونات النشطة من PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ ، تم تحديثها في عام 2021)22.
  5. استخدم SwissADME (www.swissadme.ch ، تم تحديثه في عام 2021) 23لفحص المكونات ذات الامتصاص العالي للجهاز الهضمي (GI) كتشابه دوائي (Lipinski ، Ghose ، Veber ، Egan ، Muegge) التي كانت ≥ 2 من العناصر "نعم". أدى ذلك إلى المكونات النشطة ل Bombyx Batryticatus و Cicadae Periostracum.
  6. قم باستيرادها إلى قاعدة بيانات TCMSP للتنبؤ بالبروتين المستهدف (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php ، الإصدار 2.3) 18.
  7. توحيد الأهداف في قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org ، تم تحديثها في عام 2021) مع تعيين الحالة على أنها تمت مراجعتها ومجموعة الأنواع على أنها Human24.

2. DN جمع الهدف المقابل

  1. ابحث عن اعتلال الكلية السكري من خلال GeneCards (https://www.genecards.org/ ، الإصدار 5.1) 25 ، OMIM (https://omim.org/ ، تم تحديثه في 2021) 26 ، TTD (http://db.idrblab.net/ttd/ ، تم تحديثه في 2021) 27 ، PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/ ، تم تحديثه في 2021) 28 ، وقواعد بيانات DrugBank (https://www.drugbank.ca/ ، تم تحديثه في 2021) 29. احصل على أهداف DN بعد الجمع وإزالة التكرار.
  2. فحص الأهداف المشتركة ل JWSJS و DN وبناء الشبكة
    1. فحص الأهداف الشائعة ل JWSJS و DN باستخدام برنامج R 4.2.0 ورسم مخططات Venn. قم باستيراد المكونات النشطة والأهداف المحتملة ل JWSJS إلى برنامج Cytoscape 3.8.030 لإنشاء مخطط شبكة Drug-Component-Target الذي يصور العلاقة بين الأدوية والمكونات والأهداف والأمراض.
    2. دع حجم العقدة يعكس حجم قيمة الدرجة ، حيث تشير قيمة الدرجة الأعلى إلى أن العقدة أكثر أهمية في الشبكة.
  3. بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين PPI وفحص الأهداف الأساسية
    1. تحليل الجينات المتقاطعة باستخدام منصة STRING عبر الإنترنت (الإصدار: 11.5) لبناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)31. قم ببناء الشبكة باستخدام وضع تحليل البروتين المتعدد ، واضبط الأنواع على الإنسان العاقل ، واضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل المطلوبة على >0.930.
    2. استخدم Cytoscape 3.8.0 لتحليل الشبكة طوبولوجيا ، وحساب مركزية التباين (BC) ، ومركزية التقارب (CC) ، ومركزية الدرجة (DC) ، ومركزية المتجه الذاتي (EC) ، والطريقة المحلية القائمة على الاتصال (LAC) ، وقيم مركزية الشبكة (NC) لكل عقدة ، وحجب العقد الست التي تحتوي على جميع القيم الأكبر من الوسيط32. كرر هذه العملية عدة مرات لتحديد الأهداف الأساسية ل JWSJS لعلاج DN.
  4. التحليلات الوظيفية GO وتحليل إثراء مسار KEGG
    1. إجراء تحليلات التخصيب GO و KEGG لتحديد العمليات البيولوجية والوظائف الجزيئية والمكونات الخلوية والمسارات المرتبطة بالأهداف المشتركة ل JWSJS و DN.
    2. استخدم المؤسسة. Hs.eg.db الحزمة للحصول على معرفات أهداف التقاطع، واستخدام clusterProfiler, org. حزم Hs.eg.db و EnrichPlot و ggplot2 لتحليلات الإثراء33.
    3. شاشة لتحليل التخصيب الوظيفي GO على أفضل 10 نتائج بيولوجية بقيمة P مصححة < 0.05 ، وحدد أفضل 30 مسارا بأعلى إثراء لتحليل KEGG.

3. الالتحام الجزيئي

  1. استخدم برنامج AutoDock Vina لإجراء الالتحام الجزيئي بين المكونات الأساسية ل JWSJS والأهداف الأساسية لعلاج DN34.
  2. ابحث في قاعدة بيانات PubChem للحصول على ملف sdf لهيكل 2D للمكونات الأساسية ل JWSJS. استخدم برنامج ChemBio 3D Ultra14.0 لإنشاء وتحسين هيكله ثلاثي الأبعاد ، وحفظه بتنسيق mol2 ، واستخدامه كملف ligand.
  3. ابحث عن وتنزيل تنسيق pdb لهيكل 3D للأهداف الأساسية من قاعدة بيانات Research Collab for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB). استخدم برنامج Pymol 2.4.0 لإزالة جزيئات الماء والروابط من بنية البروتين ، وحفظه بتنسيق pdb ، واستخدامه كملف مستقبلات.
  4. قم باستيراد ملف pdb للمستقبلات إلى برنامج AutoDockTools 1.5.7 للهدرجة ، وقم بتحويل كل من بروتين المستقبل وليجند الجزيء الصغير إلى تنسيق pdbqt ، وقم بتعيين جيب نشط لبروتين المستقبل مع تعيين معامل التباعد على 1.
  5. استخدم Autodock vina 1.2.0 للالتحام الجزيئي وحساب طاقة الربط ؛ إذا كان التقارب < 0 ، ضع في اعتبارك أن الجزيء يرتبط تلقائيا بالبروتين ، وتشير القيمة المطلقة الأكبر للتقارب إلى ارتباط أكثر استقرارا بينهما. أخيرا ، تصور نتائج الإرساء باستخدام برنامج Pymol 2.3.0 و LigPlot 2.2.5.

4. المحاكاة الديناميكية الجزيئية

  1. لإجراء محاكاة MD باستخدام برنامج Desmond ، اتبع الخطوات التالية:
    1. استخدم الإصدار الأكاديمي 2019-1 من برنامج ديزموند لتقييم استقرار ومرونة تفاعلات البروتين واليجند.
    2. إجراء تحقيقات ديناميكية جزيئية (MD) على ثلاثة من أكثر مجمعات الربيطة الواعدة المشتقة من دراسات الالتحام. إجراء عمليات محاكاة في بيئة مائية SPC مع 0.15 M NaCl ، وتكرار الظروف الأيونية الفسيولوجية. تم تصميم صندوق المحاكاة لضمان بقاء المذاب على بعد 10 Å على الأقل من حدوده. يتم إدخال العدادات لتحييد الشحنة الكهربائية للنظام. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تطبيق شروط الحدود الدورية ، التي تحكمها بارامترات مجال قوة OPLS 2005.
    3. ابدأ مرحلة تقليل الطاقة ل 100 حصان باستخدام معلمات ديزموند الافتراضية.
    4. ضمان استقرار درجة الحرارة والضغط عند 26.85 درجة مئوية (300 كلفن) و 1.01325 بار من خلال سلسلة Nosé-Hoover ومنهجيات Martyna-Tobias-Klein عبر جميع أنظمة MD للإنتاج. يتم تنفيذ محاكاة الديناميات الجزيئية بخطوة زمنية تبلغ 2 fs لمدة إجمالية قدرها 100 ns ، مع تسجيل الإحداثيات الذرية كل 100 ps.
    5. افتح الوحدة النمطية لمخطط تفاعلات المحاكاة (SID). قم بتحميل ملفات بيانات نتائج المحاكاة في الوحدة النمطية.
    6. حدد نوع التحليل المطلوب من الخيارات المتاحة في الوحدة (على سبيل المثال ، انحراف الجذر المتوسط التربيعي [RMSD] ، تذبذب الجذر التربيعي [RMSF] ، تحليل الترابط الهيدروجيني ، إلخ). حدد أي معلمات إضافية مطلوبة لنوع التحليل المختار.
    7. قم بتشغيل التحليل بالنقر فوق الزر "تحليل" أو "ابدأ".
    8. بمجرد اكتمال التحليل ، اعرض النتائج وفسرها داخل واجهة وحدة SID. تصدير النتائج إذا لزم الأمر لمزيد من الاستخدام أو العرض.

5. التحقق من صحة التجارب على

  1. والتصميم التجريبي
    ملاحظة: شملت هذه الدراسة 75 من ذكور فأر Sprague-Dawley ، والتي تم الحصول عليها من منشأة إنتاج حيواني من فئة SPF وكان عمرها 8 أسابيع مع كتلة جسم تبلغ 150 جم ± 20 جم (رقم شهادة الإنتاج الحيواني SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. إيواء الفئران في مختبر على مستوى SPF وتقسيمها عشوائيا إلى مجموعات طبيعية ونموذجية بعد 1 أسبوع من التغذية التكيفية. تزويد المجموعة العادية بنظام غذائي عادي والمجموعة النموذجية بنظام غذائي عالي السكر والدهون. بعد 4 أسابيع ، صوم الفئران ولكن لا تحرمها من الماء لمدة 12 ساعة.
    2. حقن المجموعة النموذجية بحقن الستربتوزوتوسين داخل الصفاق (STZ ؛ 35 مجم · كجم -1). بعد 72 ساعة ، اختبر مستويات السكر في الدم من خلال أخذ عينات دم الوريد الذيل. إذا كان مستوى الجلوكوز في الدم الصائم ≥16.7 مليمول· L-1 ، تأكيد ذلك كنموذج ناجح لمرض السكري.
    3. تأكيد نموذج DN الناجح من خلال مراقبة التغيرات النسيجية المرضية في كلية الفئران.
    4. قسم النماذج المكررة بنجاح بشكل عشوائي إلى مجموعة النماذج ، والتي تلقت JWSJS عند 4.37 جم / كجم و 8.73 جم / كجم و 17.46 جم / كجم (أي ما يعادل 3.2 و 6.3 و 12.6 ضعف الجرعة المكافئة السريرية) بالإضافة إلى مجموعة irbesartan (0.014 جم / كجم). تتكون كل مجموعة من 10 فئران. يتم تطبيق جميع الأدوية عن طريق التزويج الفموي مرة واحدة يوميا. حافظ على نظام الجرعات هذا باستمرار لمدة 4 أسابيع.
    5. تخدير الفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من 1٪ بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كغ) وتأكيد التخدير المناسب عن طريق فقدان منعكس سحب الدواسة. جمع عينات الدم من الشريان الأورطي البطني قبل القتل الرحيم.
    6. جمع الكلى بعد القتل الرحيم للفئران باستخدام حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم بجرعة 150 ملغم / كغم.
      ملاحظة: تم قتل رحيما بشكل إنساني ، وفقا لأحدث إرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) للقتل الرحيم.
  2. تحاليل الأنسجة الكلوية
    ملاحظة: تم تثبيت أنسجة الكلى في 4 ٪ بارافورمالدهيد والمجففة في الإيثانول بعد 48 ساعة. تم تضمين أقسام في البارافين. تم تقطيع المقاطع إلى شرائح رقيقة (4 ميكرومتر) لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) وحمض شيف الدوري (PAS) ، ولوحظت التغيرات المورفولوجية لأنسجة الكلى تحت المجهر الضوئي.
    1. تلطيخ:
      1. إزالة الشمع والترطيب: عالج أقسام الأنسجة بالزيلين الأول والثاني (10 دقائق لكل منهما) والكحول المطلق الأول والثاني (3 دقائق لكل منهما). ثم اغمر أقسام الأنسجة في 95٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ إيثانول (2 دقيقة لكل منهما) ، متبوعا بغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
      2. ضع أقسام الأنسجة في صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ثم فرق الأقسام بالكحول الهيدروكلوريك لمدة 5 ثوان.
      3. ضع القسم في محلول تلطيخ eosin لمدة 3 دقائق.
      4. الجفاف والتطهير والتركيب: قم بتجفيف الأقسام في أوقات مختلفة في إيثانول مختلف (70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، والإيثانول المطلق) ، ثم قم بإزالتها في الزيلين الأول والثاني ، متبوعا بالتركيب باستخدام صمغ محايد.
    2. تلطيخ PAS:
      1. اتبع خطوات إزالة الشمع الموضحة في الخطوة 5.2.1 وعالج القسم بمحلول تلطيخ الحمض الدوري لمدة ~ 8 دقائق.
      2. شطف الأجزاء في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة ثم تلطيخها بكاشف شيف لمدة 15 دقيقة في الظلام.
      3. اغسل الأقسام في ماء الصنبور لمدة 10 دقائق بعد معالجتها بكاشف شيف.
      4. قم بتلطيخ المقاطع باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ثم قم بتفريقها مع كحول حمض الهيدروكلوريك لمدة 30 ثانية. اغسل الأقسام مرة أخرى في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق لتلوين النواة باللون الأزرق.
    3. المجهر الإلكتروني:
      1. إصلاح العينات في 2.5 ٪ الجلوتارالدهيد لمدة 3 ساعات ، ثم شطفها في برنامج تلفزيوني لمدة 3 ساعات. علاوة على ذلك ، عالج العينات في حمض الأوسميك بنسبة 1٪ لمدة 3 ساعات ثم اشطفها مرة أخرى في برنامج تلفزيوني لمدة 3 ساعات.
      2. الجفاف من خلال سلسلة متدرجة من حمامات الكحول تنتهي بالأسيتون (تستمر كل خطوة حوالي 2 ساعة إجمالا).
      3. تسلل العينات بمزيج من البروبان الايبوكسي وراتنجات الايبوكسي (1: 1) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة ساعتين ، متبوعا براتنجات الايبوكسي النقية عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة إضافية.
      4. بعد ذلك ، قم بمعالجة العينات وتصلبها في درجات حرارة عالية بشكل متزايد على مدار 36 ساعة قبل التقسيم. تضمن هذه العملية تسلل الأنسجة تماما باستخدام الراتنج ، والذي يتم تقويته بعد ذلك للسماح بالتقطيع الرقيق للمجهر الإلكتروني.
      5. صبغ مزدوج مع 3٪ أسيتات اليورانيل وحمض الرصاص ، ومراقبة العينات وتصويرها بواسطة المجهر الإلكتروني في غضون 15 دقيقة.
        ملاحظة: إعدادات المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) هي كما يلي: تكبير 7000x في وضع التباين العالي (Zoom-1 HC-1) ، مع جهد متسارع يبلغ 80.0 كيلو فولت على نظام TEM.
  3. الكيمياء الهيستولوجية المناعية
    1. إزالة الشمع: ضع أقسام الأنسجة في الزيلين الأول والثاني لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    2. الإماهة: إعادة ترطيب أقسام الأنسجة منزوعة الشمع عن طريق وضعها على التوالي في الإيثانول المطلق الأول والثاني لمدة 3 دقائق لكل منهما ، تليها 95٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ إيثانول لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
    3. استرجاع المستضد: اغمر أقسام الأنسجة في محلول عازلة لحمض السيترات والستريك 0.1 متر تحت ضغط عال لمدة 5 دقائق ثم تبرد إلى RT.
    4. الحجب: لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة ، يتم حظره عن طريق احتضان أقسام الأنسجة بمصل الماعز الطبيعي بنسبة 5٪ عند حوالي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    5. حضانة الأجسام المضادة الأولية: أضف الأجسام المضادة الأولية p-EGFR (مخفف 1: 200) و p-MAPK3 / 1 (مخفف 1: 200) على أقسام الأنسجة واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية داخل غرفة مرطبة.
    6. حضانة الأجسام المضادة الثانوية: اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ، ثم أضف الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة البيوتين (مخففة في برنامج تلفزيوني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) على الأقسام واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. ضع محلول عمل الستربتافيدين المقترن بالفجل على أقسام الأنسجة عند 37 درجة مئوية متبوعا بالغسيل ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    8. لتطوير DAB ، احتضان الأقسام بمحلول تطوير DAB (3 دقائق في الظلام في RT) ، متبوعا بالشطف بالماء المقطر. يعمل DAB كركيزة كروموجينية لإنزيم بيروكسيديز الفجل (HRP) ، والذي يتحول إلى اللون البني عند الأكسدة.
    9. استخدم الهيماتوكسيلين للتلوين لمدة 2 دقيقة تقريبا ، وقم بتمييز الأقسام التي تحتوي على كحول هيدروكلوريك بنسبة 1٪ لمدة 5 ثوان ، ثم اغسلها تحت الماء الجاري لتتحول إلى اللون الأزرق.
    10. قم بالجفاف عن طريق وضع الأقسام على التوالي في سلسلة من الإيثانول من تركيز منخفض إلى مرتفع ، واضح في الزيلين الأول والثاني ، وقم بتركيب المقاطع بصمغ محايد.
      ملاحظة: يستغرق هذا الإجراء حوالي 18-24 ساعة ، بما في ذلك حضانة الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها.
    11. حدد عشوائيا ثلاثة حقول مرئية (200x) لكل قسم وقم بتحليل نتائج تلطيخ الأقسام باستخدام برنامج تحليل الصور. تم استخدام برنامج Image Pro Plus 6.0 باتباع الخطوات أدناه.
    12. أولا ، قم باستيراد صورة للقسم إلى البرنامج.
    13. تصحيح الكثافة: لضمان نتائج دقيقة ، قم بإجراء تصحيح الكثافة.
      1. انتقل لقياس كثافة > المعايرة > > > الأمراض المنقولة جنسيا الجديدة. خيارات > الكثافة الاختيارية > الصورة. ثم ، انقر فوق منطقة فارغة من الصورة لتسجيل قيمة الخلفية وتأكيدها بالنقر فوق "موافق".
    14. إعداد معلمات القياس: إعداد معلمات القياس لحساب المساحة والكثافة البصرية المتكاملة (IOD).
      1. انقر فوق قياس > العدد / الحجم > قياس > تحديد القياسات. حدد Area(100) وIOD، ثم انقر فوق موافق.
      2. انتقل إلى الخيارات ، وتحقق من الخلفية الداكنة في العينة ، والتصفية المسبقة 4-Connect وانقر فوق موافق.
    15. اختيار اللون: لتحديد الإيجابية بدقة ، حدد الألوان لاكتشاف المناطق الملطخة مقابل المناطق غير الملوثة.
      1. انقر فوق تحديد الألوان > الرسم البياني بناء > HSI. اضبط قيمة H وفقا للصورة مع الحفاظ على S دون تغيير وأنا تتراوح بين صفر وقيمة الخلفية. ثم قم بالتأكيد بالنقر فوق إغلاق.
      2. جمع البيانات وحسابها: قم بجمع البيانات وحسابها بالنقر فوق قياس > تخطيط > جامع البيانات ، حيث يتم تحديد الاسم والمنطقة (المجموع) و IOD (المجموع ). ثم ، انقر فوق عد > جمع الآن > قائمة البيانات لتصدير البيانات لمزيد من التحليل أو التخزين.
        ملاحظة: نتج عن ذلك قياس شبه كمي لتعبير البروتين في كل قسم من حيث IOD / المنطقة ، مما يشير إلى كمية البروتين الموجودة بالنسبة إلى المساحة الكلية التي تم تحليلها.
  4. النشاف الغربي
    1. الحصول على أنسجة الكلى وتقطيعها إلى قطع. ضع هذه القطع في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وأضف محلول تحلل البروتين المبرد مسبقا (50 mM Tris [pH 7.4] ، 150 mM NaCl ، 1٪ Triton X-100 ، 1٪ deoxycholate الصوديوم ، 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم [SDS]) ، وقم بالتجانس.
    2. اتركه على الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم جهاز طرد مركزي عند 13400 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتخزين العينة الناتجة في مجمد بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
    3. استخدم طريقة برادفورد لتحديد البروتينات.
      1. قم بإعداد محلول العمل Coomassie Brilliant Blue عن طريق خلط الكاشف والماء المقطر بنسبة 1: 4.
      2. قم بإنشاء ثلاث مجموعات - فارغة ، ومجموعة البروتين القياسية ، ومجموعة عينة البروتين. أضف 3 مل من محلول العمل Coomassie Brilliant Blue لكل مجموعة ، جنبا إلى جنب مع محلول ملحي فسيولوجي للمجموعة الفارغة ، والبروتين القياسي للمجموعة القياسية ، والبروتين الطافي المستخرج لمجموعة العينة.
      3. بعد ترك المخاليط تقف لمدة 5 دقائق ، قم بقياس قيم امتصاصها باستخدام مقياس الطيف الضوئي فوق البنفسجي.
      4. احسب تركيز العينة باستخدام هذه الصيغة: تركيز البروتين (ملغم / مل) = (قيمة امتصاص العينة / قيمة امتصاص الأنبوب القياسية) × تركيز البروتين القياسي × 5.
    4. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للتحميل 6x لكل عينة بروتين. تغلي على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل تناولها وتخزينها في فريزر -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    5. أداء الكهربائي القياسي ، النشاف ، والحجب.
      1. أداء SDS-بولي أكريلاميد هلام الكهربائي القياسي (PAGE) باستخدام هلام حل 12 ٪. ضع جهدا ثابتا يبلغ 100 فولت لجل التراص و 120 فولت لهلام الحل حتى تصل واجهة الصبغة إلى قاع الجل.
      2. نقل البروتينات إلى أغشية البولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF) عند 100 فولت لمدة 2 ساعة في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية باستخدام نظام نقل رطب.
      3. بعد نقل البروتين ، قم بسد الأغشية التي تحتوي على 5٪ حليب خالي الدسم في TBST لمدة 1 ساعة في RT.
    6. تمييع الأجسام المضادة الأولية EGFR (1: 2,000) ، p-EGFR (1: 2,000) ، MAPK3 / 1 (1: 2,000) ، p-MAPK3 / 1 (1: 2,000) ، Bcl-2 (1: 2,000) ، BAX (1: 2,000) ، و CAPDH (1: 5,000) في TBST مع 5٪ BSA. أضف هذه الأجسام المضادة الأولية المخففة واحتضن الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تحريض لطيف.
    7. بعد غسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST ، أضف أجساما مضادة ثانوية مخففة (1: 5000) ، تليها الحضانة لمدة ساعة واحدة. بعد تطوير الألوان ، قم بإجراء تحليل كمي للنطاقات المستهدفة باستخدام برنامج ImageJ.
  5. تحليل qPCR
    1. التجميع: تعيين عينات للمجموعات - التحكم ، DN ، Irbesartan ، JWSJS-L ، JWSJS-M ، JWSJS-H.
    2. استخراج الحمض النووي الريبي: إجراء تجانس الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي ، تليها إضافة الكلوروفورم ، والطرد المركزي ، وترسيب الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    3. ترسيب الحمض النووي الريبي والغسيل: ترسب الحمض النووي الريبي مع الأيزوبروبانول ويغسل بالإيثانول.
    4. إذابة الحمض النووي الريبي: جفف حبيبات الحمض النووي الريبي وقم بإذابتها في الماء المعالج ب DEPC.
    5. تخليق cDNA: قم بإجراء النسخ العكسي باستخدام مخاليط تفاعل محددة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    6. تضخيم qPCR: استخدم مواد أولية محددة ل GAPDH و MAPK3 و MAPK1 و EGFR ل qPCR وقم بإجراء التضخيم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      كانت تسلسلات التمهيدي على النحو التالي:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCACCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3 ، R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. الأساليب الإحصائية

  1. قم بإجراء التحليل باستخدام البرنامج المناسب (على سبيل المثال ، SPSS) وتمثيل البيانات المقاسة كمتوسط ± الانحراف المعياري. إذا استوفت البيانات معايير التوزيع الطبيعي وتجانس التباين ، قارن بين المجموعات باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه وقم بإجراء مقارنات متعددة مع طريقة Bonferroni.
  2. استخدم اختبار T2 لإجراء مقارنات متعددة إذا كان التباين غير متجانس. ضع في اعتبارك P < 0.05 كدلالة إحصائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد البروتوكول ، تم الحصول أخيرا على 90 مكونا نشطا من JWSJS من التحليل بعد الفحص وإلغاء البيانات المكررة وفقا للمعايير المحددة ل OB و DL. وشملت هذه الأنواع 20 نوعا من Hedysarum multijugum مكسيم ، و 23 نوعا من Epimrdii Herba ، و 15 نوعا من Smilacis Glabrae Rhixoma ، و 16 نوعا من Radix Rhei et Rhizome ، و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

استخدمت دراستنا مزيجا من علم الأدوية الشبكي ، والالتحام الجزيئي ، والنماذج الحيوانية في الجسم الحي . وتمثلت إحدى الخطوات الحاسمة في إنشاء شبكة "هدف مكون الدواء"، التي كانت حاسمة لتحديد الآليات المحتملة ل JWSJS في معالجة DN، مع التركيز بشكل خاص على تفاعلها مع مسار الإشا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل المشروع العام لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة خبي ، الصين (رقم H2019423037).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2×SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Automatic biochemical analysis instrumentHitachi, Japan7170A
Anhydrous EthanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Primary antibodies Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Primary antibodies Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopeOlympus, JapanBX53
Chloroform SubstituteECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARelease 2019-1
Digital Constant Temperature Water BathChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Fasting blood glucose (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Primary antibodies Affinity, USAAF7021Rat
Glycated serum protein (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Transmission electron microscopeHitachi, JapanH-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solutionServicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Real-Time PCR Amplification InstrumentApplied Biosystems, USAiQ5 
Irbesartan tabletsHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China TGL-16K
Mini trans-blot transfer systemBio-Rad, USAN/A
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad, USAN/A
NanoVue Plus SpectrophotometerHealthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765
p-EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF3044Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies Affinity, USAAF1015Rat
Secondary antibodies Santa Cruz, USAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, USAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 

References

  1. Viigimaa, M., Sachinidis, A., Toumpourleka, M., Koutsampasopoulos, K., Alliksoo, S., Titma, T. Macrovascular complications of Type 2 diabetes mellitus. Curr Vasc Pharmacol. 18 (2), 110-116 (2020).
  2. Umanath, K., Lewis, J. B. Update on diabetic nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 71 (6), 884-895 (2018).
  3. Han, W., et al. Huangkui capsule alleviates renal tubular epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy via inhibiting NLRP3 inflammasome activation and TLR4/NF-kappaB signaling. Phytomedicine. 57, 203-214 (2019).
  4. Giralt-Lopez, A., et al. Revisiting experimental models of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 21 (10), 3587(2020).
  5. Lu, Z., Zhong, Y., Liu, W., Xiang, L., Deng, Y. the efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease. J Diabetes Res. 2019, 2697672(2019).
  6. Niu, H., et al. The therapeutic mechanism of PuRenDan for the treatment of diabetic nephropathy: Network pharmacology and experimental verification. J Ethnopharmacol. 293, 115283(2022).
  7. Gao, F., Wang, Z., Yang, B., Tan, J. Mechanism of Jiawei Shengjiang San in the treatment of membranous nephropathy based on network pharmacology. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 37 (5), 132-138 (2021).
  8. Li, W., Xie, M. Analysis of composing and application rule in the evolution of Shengjiang San. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 44 (10), 894-898 (2021).
  9. Zhang, Y., et al. Mechanism of Jiawei Shengjiang powder in inhibiting renal inflammation and fibrosis in diabetic rats based on TLR4/NF-kappaB and Raf/MEK pathways. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (5), 20-27 (2022).
  10. Zhao, L., et al. Pharmacodynamic mechanism of Yishen Tongluo Formula in treatment of diabetic kidney disease based on network pharmacology and verification of key regulation pathway. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 45 (8), 824-834 (2022).
  11. Zhang, J., Liang, R., Wang, L., Yang, B. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology. J Ethnopharmacol. 229, 104-114 (2019).
  12. Chen, L., et al. Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure. J Ethnopharmacol. 219, 359-368 (2018).
  13. Zhu, M., Qin, Y. C., Gao, C. Q., Yan, H. C., Wang, X. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food Funct. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  14. Ding, Z., et al. Systems pharmacology reveals the mechanism of activity of Ge-Gen-Qin-Lian decoction against LPS-induced acute lung injury: A novel strategy for exploring active components and effective mechanism of TCM formulae. Pharmacol Res. 156, 104759(2020).
  15. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412(2010).
  17. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guides for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press (US). Washington (DC. (2011).
  18. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  19. Xu, X., et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 13 (6), 6964-6982 (2012).
  20. Tao, W., et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease. J Ethnopharmacol. 145 (1), 1-10 (2013).
  21. Traditional Chinese Medicine and Chemical Composition databases in Chemistry Database[DB/OL]. , Available from: http://www.organchem.csdb.cn (2021).
  22. Halladay, C. W., Trikalinos, T. A., Schmid, I. T., Schmid, C. H., Dahabreh, I. J. Using data sources beyond PubMed has a modest impact on the results of systematic reviews of therapeutic interventions. J Clin Epidemiol. 68 (9), 1076-1084 (2015).
  23. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7, 42717(2017).
  24. UniProt, C. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 40 (D1), D71-D75 (2012).
  25. Stelzer, G., et al. The GeneCards Suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1-33 (2016).
  26. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Curr Protoc Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  27. Zhou, Y., et al. Therapeutic target database update 2022: facilitating drug discovery with enriched comparative data of targeted agents. Nucleic Acids Res. 50 (D1), D1398-D1407 (2022).
  28. Whirl-Carrillo, M., et al. Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 92 (4), 414-417 (2012).
  29. Law, V., et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic Acids Res. 42 (D1), D1091-D1097 (2014).
  30. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  31. Xu, J., et al. Pharmacological mechanisms underlying the neuroprotective effects of Alpinia oxyphylla Miq. on Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 2071(2020).
  32. Tang, Y., Li, M., Wang, J., Pan, Y., Wu, F. X. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks. Biosystems. 127, 67-72 (2015).
  33. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  34. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  35. Yang, X., et al. Rational selection of the 3D structure of biomacromolecules for molecular docking studies on the mechanism of endocrine disruptor action. Chem Res Toxicol. 29 (9), 1565-1570 (2016).
  36. Diller, D. J., Merz, K. M. throughput docking for library design and library prioritization. Proteins. 43 (2), 113-124 (2001).
  37. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PLoS One. 8 (12), e83922(2013).
  38. Godse, N. R., et al. TMEM16A/ANO1 inhibits apoptosis via downregulation of Bim expression. Clin Cancer Res. 23 (23), 7324-7332 (2017).
  39. Ilhan, I., et al. Irbesartan decreased mitochondrial stress-related apoptosis in cisplatin-induced acute kidney injury via regulating BCL-2/BAX signaling. Mol Biol Rep. 49 (7), 6125-6133 (2022).
  40. Lee, M., et al. Protective effect of hydroxysafflor yellow a on nephropathy by attenuating oxidative stress and inhibiting apoptosis in induced Type 2 diabetes in rat. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7805393(2020).
  41. Schlessinger, J. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell. 110 (6), 669-672 (2002).
  42. Gu, X., Chu, L., Kang, Y. Angiogenic factor-based signature predicts prognosis and immunotherapy response in non-small-cell lung cancer. Front Genet. 13, 894024(2022).
  43. Chu, L., et al. Age-related changes in endogenous glucocorticoids, gonadal steroids, endocannabinoids and their ratios in plasma and hair from the male C57BL/6 mice. Gen Comp Endocrinol. 301, 113651(2021).
  44. Chen, J., Chen, J. K., Harris, R. C. EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 26 (5), 1115-1125 (2015).
  45. Skibba, M., et al. New EGFR inhibitor, 453, prevents renal fibrosis in angiotensin II-stimulated mice. Eur J Pharmacol. 789, 421-430 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207 EGFR MAPK3 1 PI3K Akt HIF 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved