العزل المغناطيسي المناعي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية من الفئران

Summary

أنشأت هذه الدراسة طريقة مستقرة وفعالة للعزل والثقافة والتحديد الوظيفي للخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية (CD34 ⁺ VW-SCs). يمكن استخدام طريقة العزل سهلة المتابعة والفعالة من قبل باحثين آخرين لدراسة الآليات المحتملة التي تنطوي عليها أمراض القلب والأوعية الدموية.

Abstract

يتم التعرف بشكل متزايد على الخلايا الجذعية والسلفية المقيمة في جدار الأوعية الدموية CD34 ⁺ (VW-SCs) لدورها الحاسم في تنظيم إصابات الأوعية الدموية وإصلاحها. يعد إنشاء طريقة مستقرة وفعالة لزراعة الفئران الوظيفية CD34 ⁺ VW-SCs أمرا ضروريا لمزيد من التحقيق في الآليات التي ينطوي عليها انتشار هذه الخلايا وهجرتها وتمايزها في ظل ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. تجمع الطريقة الموصوفة بين فحص الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي لتنقية CD34 ⁺ VW-SCs المقيمة الأولية. ثم يتم تحديد الخلايا النقية وظيفيا من خلال تلطيخ التألق المناعي وتصوير الكالسيوم²⁺ . باختصار ، يتم الحصول على الخلايا الوعائية من adventitia من الشريان الأورطي الفئران والشريان المساريقي من خلال ربط كتلة الأنسجة ، تليها زراعة فرعية حتى تصل إلى عدد الخلايا على الأقل 1 × 10⁷. بعد ذلك ، يتم تنقية CD34 ⁺ VW-SCs باستخدام فرز الخرزة المغناطيسية وقياس التدفق الخلوي. يتضمن تحديد CD34 ⁺ VW-SCs تلطيخ التألق المناعي الخلوي ، بينما يتم تحديد تعدد القدرات الوظيفية عن طريق تعريض الخلايا لوسط ثقافة معين للتمايز الموجه. علاوة على ذلك ، يتم تقييم إطلاق Ca²⁺ الداخلي الوظيفي وإدخال Ca²⁺ الخارجي باستخدام محطة عمل تصوير متاحة تجاريا في الخلايا المحملة ب Fura-2 / AM المعرضة ل ATP أو الكافيين أو thapsigargin (TG). توفر هذه الطريقة تقنية مستقرة وفعالة لعزل وزراعة وتحديد الخلايا الجذعية CD34 ⁺ المقيمة في جدار الأوعية الدموية ، مما يوفر فرصة للدراسات المختبرية حول الآليات التنظيمية ل VW-SCs وفحص الأدوية المستهدفة.

Introduction

يلعب جدار الأوعية الدموية دورا محوريا في نمو الأوعية الدموية ، وتنظيم الاستتباب ، وتطور أمراض الأوعية الدموية. في السنوات الأخيرة ، كشفت العديد من الدراسات عن وجود سلالات مختلفة من الخلايا الجذعية في الشرايين. في عام 2004 ، أبلغت مجموعة البروفيسور Qingbo Xu لأول مرة عن وجود خلايا جذعية / سلفية وعائية في محيط جدار الأوعية الدموية للبالغين ، معبرة عن CD34 و Sca-1 و c-kit و Flk-1¹. تظهر هذه الخلايا الجذعية الوعائية إمكانية التمايز والانتشار متعدد الاتجاهات. في ظل الظروف العادية ، تظل هادئة نسبيا. ومع ذلك ، عند تنشيطها بواسطة عوامل محددة ، يمكن أن تتمايز إلى خلايا العضلات الملساء والخلايا البطانية والخلايا الليفية. بدلا من ذلك ، يمكنهم تنظيم المصفو....

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة ، وتم التعامل مع وفقا للمبادئ التوجيهية لإدارة واستخدام المختبر في الصين. التزم البحث التزاما صارما بالمتطلبات الأخلاقية للتجارب على ، بموافقة لجنة أخلاقيات (رقم الموافقة: SWMU2020664). تم استخدام الفئران السليمة C57BL / 6 البالغة من العمر ثمانية أسابيع من كلا الجنسين ، والتي يتراوح وزنها بين 18-20 جم ، في الدراسة الحالية. تم إيواء في مركز المختبر بجامعة ساوث ويست الطبية (SWMU).

1. زراعة كتلة الأنسجة من adventitia من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية

1. عزل CD34 ⁺ VW-SCs المقيم
   1. تخدير فأرين باستنشاق 3٪ إيزوفلوران (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تأكيد التخدير الك....

النتائج

عزل وتنقية CD34⁺ VW-SCs
يتم الحصول على درجة نقاء عالية من CD34 ⁺ VW-SCs من عرضية الشريان الأبهري والمساريقي للفأر عن طريق ربط الأنسجة وفرز الميكروبيدات المغناطيسية. النسبة المئوية لخلايا CD34 ⁺ في جدار الوعاء الدموي بشكل عام 10٪ -30٪. يؤكد قياس التدفق الخلوي أن نقاء خلايا CD34

Discussion

توفر هذه الدراسة طريقة سريعة ومريحة للحصول على CD34 ⁺ VW-SCs الوظيفية من الشريان الأورطي والشرايين المساريقية للفئران. CD34 ⁺ VW-SCs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة لها نشاط تكاثري وخصائص تمايز متعددة الاتجاهات. مستقبلات إينوزيتول ثلاثي الفوسفات 1،4،5-ثلاثي الفوسفات (IP₃Rs) ، مستقبل.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023