JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا شاملا لتوليد وتحليل المصب لعضويات الدماغ البشري باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والنواة الواحدة.

Abstract

على مدى العقد الماضي ، تطورت النسخ أحادية الخلية بشكل كبير وأصبحت طريقة مختبرية قياسية للتحليل المتزامن لملفات تعريف التعبير الجيني للخلايا الفردية ، مما يسمح بالتقاط التنوع الخلوي. من أجل التغلب على القيود التي تفرضها أنواع الخلايا التي يصعب عزلها ، يمكن استخدام نهج بديل يهدف إلى استعادة النوى المفردة بدلا من الخلايا السليمة للتسلسل ، مما يجعل التنميط النسخي للخلايا الفردية قابلا للتطبيق عالميا. أصبحت هذه التقنيات حجر الزاوية في دراسة عضويات الدماغ ، وتأسيسها كنماذج للدماغ البشري النامي. من خلال الاستفادة من إمكانات النسخ أحادية الخلية والنواة المفردة في أبحاث الأعضاء في الدماغ ، يقدم هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة يشمل الإجراءات الرئيسية مثل تفكك الأعضاء ، وعزل الخلية الواحدة أو النوى ، وإعداد المكتبة والتسلسل. من خلال تنفيذ هذه الأساليب البديلة ، يمكن للباحثين الحصول على مجموعات بيانات عالية الجودة ، مما يتيح تحديد أنواع الخلايا العصبية وغير العصبية ، وملامح التعبير الجيني ، ومسارات نسب الخلايا. هذا يسهل التحقيقات الشاملة في العمليات الخلوية والآليات الجزيئية التي تشكل نمو الدماغ.

Introduction

على مدى السنوات الماضية ، ظهرت تقنيات الأعضاء كأداة واعدة لزراعة الأنسجة الشبيهةبالأعضاء 1،2،3. خاصة بالنسبة للأعضاء التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة ، مثل الدماغ البشري ، توفر الكائنات العضوية الفرصة لاكتساب نظرة ثاقبة على التطور ومظاهر المرض4. على هذا النحو ، تم استخدام عضويات الدماغ على نطاق واسع كنموذج تجريبي للتحقيق في اضطرابات الدماغ البشرية المختلفة ، بما في ذلك الأمراض التنموية أو النفسية أو حتى الأمراض التنكسية العصبية4،5،6.

مع ظهور تقنيات التنميط بالنسخ أحادية الخلية ، يمكن دراسة الأنسجة البشرية الأولية والنماذج المعقدة في المختبر بمستوى غير مسبوق من الدقة ، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول تغيرات التعبير الجيني على مستوى المجموعات السكانية الفرعية للخلايا في الصحة والمرض والإبلاغ عن الأهداف العلاجية المفترضة الجديدة7،8،9. تقدم مجال العضوي من خلال استخدام التنميط النسخي أحادي الخلية لتقييم التركيب الخلوي وقابلية التكاثر ودقة تقنيات الدماغ العضوية10،11،12. مكن تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) من تصنيف الخلايا وتحديد عدم التنظيم الجيني في الكائنات العضوية المريضة13,14. الأهم من ذلك ، هو تعقيد الأنسجة العضوية التي تستلزم تنفيذ التقنيات التي تمكن من تنميط الخلايا الفردية. يؤدي توصيف المواد العضوية باستخدام طرق مثل التنميط بالنسخ السائب (تسلسل الحمض النووي الريبي السائب) إلى عدم تجانس خلوي مقنع وملامح التعبير الجيني التي يتم حسابها في المتوسط عبر جميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة المعقدة ، مما يحد في النهاية من فهمنا للعمليات الجارية أثناء تطور الأعضاء في الصحة والمرض15،16،17. مع استمرار تقدم طرق scRNA-seq ، يتم إنشاء عدد متزايد من الأطالس ، ويتجلى ذلك في موارد مثل أطلس ألين للدماغ أو أطلس الخلية المفردة لعضويات الدماغ البشري بواسطة Uzquiano et al.18.

يعتمد تحقيق scRNA-seq الناجح من عضويات الدماغ على العزلة الفعالة والتقاط الخلايا السليمة. نظرا لأن تفكك عضويات الدماغ للحصول على خلايا فردية يعتمد على الهضم الأنزيمي ، فإنه يمكن أن يؤثر على أنماط التعبير الجيني عن طريق إحداث الإجهاد وتلف الخلايا19,20. وبالتالي ، فإن تفكك الأنسجة إلى خلايا فردية هو الخطوة الأكثر أهمية. النهج البديل هو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNA-seq) ، والذي يسهل استخراج النوى الخالية من الإنزيم من الأنسجة الطازجة والمجمدة21,22. ومع ذلك ، فإن عزل النوى عن الأنسجة يطرح تحديات أخرى مثل إثراء أنواع الخلايا ذات الأهمية وانخفاض محتوى الحمض النووي الريبي للنوى مقارنة بالخلايا.

عادة ما يتم إجراء دراسات Transcriptome لعضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq10،18،23. ومع ذلك ، قد يوفر عزل النوى المفردة طريقة متعامدة وتكميلية للتحقق من المظهر النسخي للعضويات. هنا ، نقدم صندوق أدوات ل scRNA- و snRNA-seq لعضويات الدماغ ونناقش النقاط الحرجة للحصول على أفضل بيانات التسلسل جودة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول الموصوف في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 1 التابع لمركز ماكس ديلبروك للطب الجزيئي (رقم الموافقة: 138/08) ، وفقا للمتطلبات وامتثالا لقواعد الاتحاد الأوروبي والقواعد الوطنية بشأن الأخلاقيات في البحث.

1. اشتقاق عضويات الدماغ الأمامي من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول لعدة خطوط iPSC مختلفة مستزرعة في مجموعة متنوعة من وسائط الخلايا الجذعية من شركات مختلفة (الجدول 1). يعتمد توليد عضويات الدماغ الأمامي بشكل كبير على iPSCs عالية الجودة والتقاء 60٪ -70٪ قبل بدء البروتوكول. هنا استخدمنا خط خلية متاح تجاريا (انظر جدول المواد).

  1. اليوم 0: تكوين الجسم الجنيني
    1. لمعالجة صفيحة 96 بئرا بمحلول بلوروني ، أضف 80 ميكرولتر من محلول بلوروني معقم مصفى بنسبة 2٪ لكل بئر من صفيحة قاع U ذات 96 بئرا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المعالجة متعددة الطبقات في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع ويمكن استخدامها مباشرة دون أي خطوات غسيل لتشكيل الجسم الجنيني.
    2. قم بإزالة محلول pluronic من كل بئر باستخدام شفاط أو ماصة متعددة القنوات قبل بذر الخلايا.
    3. قبل البدء ، قم بإعداد الكواشف التالية للوحة واحدة ذات 96 بئرا: أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع 5 مل من DMEM المسخن مسبقا: F12 medium. 11 مل من وسط الخلايا الجذعية المكمل ب 50 ميكرومتر Y-27632 ، صفيحة معالجة متعددة الأطراف (كما هو موضح أعلاه).
    4. قم بشفط الوسائط من بئر واحد من لوحة ذات 6 آبار من 60-70٪ من iPSCs المتقاربة. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 500 ميكرولتر من الكاشف القائم على التربسين واحتضانه لمدة 2-6 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة للانفصال المناسب للخلايا باستخدام الكاشف القائم على التربسين على كثافة الخلية وخصائص لاصقة مصفوفة الخلية لكل خط iPSC. لتجنب الإفراط في الهضم ، ينصح بفحص مورفولوجيا الخلية بعد 2 دقيقة من الحضانة باستخدام كاشف قائم على التربسين باستخدام مجهر المجال الساطع.
    5. افصل الخلايا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل المعد مسبقا باستخدام وسيط DMEM: F12 لوقف التفكك.
    6. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم. نضح طاف والحفاظ على بيليه الخلية. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط الخلايا الجذعية المكمل ب 50 ميكرومتر Y-27632.
    7. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا وأضف العدد المطلوب من الخلايا إلى وسائط الخلايا الجذعية المكملة ب 50 ميكرومتر Y-27632. يتطلب توليد جسم جنيني واحد 3000-12000 خلية اعتمادا على خط الخلية.
    8. انقل معلق الخلية إلى خزان كاشف متعدد القنوات باستخدام ماصة سعة 10 مل. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، لوحة 100 ميكرولتر / بئر من تعليق الخلية في لوحة 96 بئر المعالجة سابقا pluronic.
    9. ضع صفيحة 96 بئرا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ O2 و 5٪ CO2. لتجنب أي اضطراب أثناء تكوين الجسم الجنيني ، امتنع عن تحريك اللوحة.
  2. اليوم 2: فحص تكوين الجسم الجنيني
    1. افحص تكوين الجسم الجنيني باستخدام هدف 10x من مجهر المجال الساطع. يجب أن تظهر الأجسام الجنينية حوافا واضحة والحد الأدنى من موت الخلايا.
    2. نضح أكبر قدر ممكن من الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر / بئر من وسط الخلايا الجذعية. (حرجة) تتم إزالة الأجسام الجنينية بسهولة من البئر أثناء التبادل المتوسط. انتبه إلى عدم إزالتها ، لذلك راقب الوسيط بعد الطموح.
  3. اليوم 3: تحريض الأديم الظاهر العصبي
    1. نضح أكبر قدر ممكن من الوسط واستبدله ب 120 ميكرولتر / بئر من وسط الحث وضع اللوحة عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 و 5٪ CO2.
  4. اليوم 6: التضمين
    1. اعتمادا على خط iPSC ، يلزم 3 أو 4 أيام للحث على ظهور الأديم الظاهر العصبي. مراقبة الأجسام الجنينية بانتظام. بمجرد أن تصبح الحواف ساطعة ، تكون الأجسام الجنينية جاهزة للتضمين. استخدم إحدى الطريقتين المختلفتين اللتين يمكن استخدامهما لتضمين الجسم الجنيني كما هو موضح أدناه24.
    2. طريقة التضمين 1: تضمين ملفات تعريف الارتباط
      1. قم بإذابة حصة من هلام المصفوفة خارج الخلية غير المخفف على الجليد لمدة 1-2 ساعة. (حرج) احتفظ دائما بهلام مصفوفة خارج الخلية على الجليد لمنعه من التصلب. قم بإعداد الحصص مسبقا لتقليل وقت الذوبان ودورات الذوبان المتكررة.
      2. قطع طرف ماصة 200 ميكرولتر باستخدام كماشة مخلب وجمع 16-32 جثة جنينية في أنبوب طرد مركزي واحد 1.5 مل.
      3. نقل الأجسام الجنينية في 67 ميكرولتر من الوسائط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أضف 100 ميكرولتر من جل المصفوفة خارج الخلية باستخدام طرف ماصة مقطوع 200 ميكرولتر واخلطه برفق.
      4. وزعي الأجسام الجنينية بالتساوي في طبق 6 سم وضعي الطبق لمدة 5-10 دقائق للسماح لهلام المصفوفة خارج الخلية بالتصلب.
      5. أضف حوالي 4 مل من وسائط التمايز واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، ضع الطبق على شاكر مداري (84 دورة في الدقيقة). تأكد من انفصال جميع الأجسام الجنينية عن القاع. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم طرف ماصة مقطوع ووسائط لفصلهما برفق.
    3. طريقة التضمين 2: التضمين السائل
      1. قم بإذابة قسمة من هلام المصفوفة خارج الخلية غير المخفف على الجليد لمدة 1-2 ساعة ووضع وسائط التمايز على الجليد. (حرجة) يجب أن تكون الوسائط باردة عند إضافة هلام مصفوفة خارج الخلية.
      2. بمجرد أن يصبح الوسط باردا ، أضف هلام مصفوفة خارج الخلية إلى التركيز النهائي البالغ 2٪. قطع طرف ماصة 200 ميكرولتر باستخدام كماشة مخالب ونقل ما يصل إلى 24 جثة جنينية إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار.
      3. قم بإزالة جميع الوسائط الزائدة وأضف حوالي 4 مل من 2٪ من هلام المصفوفة خارج الخلية / وسائط التمايز في بئر واحد من لوحة 6 آبار. ضع اللوحة على الفور على شاكر المداري (84 دورة في الدقيقة).
  5. اليوم 9-20: قم بإجراء تبادل وسائط كامل باستخدام وسائط التمايز كل 3-4 أيام.
  6. اليوم 21-30: نقل المواد العضوية إلى وسائط النضج وإجراء تبادلات وسائط كاملة كل 3-4 أيام.
  7. تفكك المواد العضوية: لتفكك النوى المفردة والخلايا ، استخدم المواد العضوية ذات الجودة العالية. لتجنب الكميات الزائدة من موت الخلايا ، قم بقطع المواد العضوية بانتظام لمنع تراكم النواة الميتة والسماح لها بالتعافي لمدة 2 أسابيع قبل فصلها لمزيد من التحليل.

2. اشتقاق خلية واحدة من المواد العضوية

ملاحظة: يتم إجراء تفكك الخلية المفردة باستخدام مجموعة تفكك الأنسجة العصبية (الجدول 2) ، والتي تستخدم التفكك الميكانيكي والأنزيمي. هنا نصف التفكك الميكانيكي اليدوي. كبديل ، يمكن استخدام آلة التفكك.

  1. تحضير محلول STOP و 0.04٪ BSA على الجليد. تحضير مزيج الانزيم 1 و 2 و 0.04٪ BSA في برنامج تلفزيوني ووضعه على الجليد.
  2. اجمع ما يصل إلى 5 مواد عضوية في بئر واحدة من صفيحة ذات 6 آبار ونضح الوسائط الزائدة واغسلها مرة واحدة باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة وسائط الثقافة. ضع المواد العضوية في منتصف البئر وباستخدام مشرط ، قم بفرم المواد العضوية جيدا.
  3. يضاف مزيج الإنزيم 1 ويوضع عند 37 درجة مئوية ، 20٪ O2 و 5٪ CO2 ، ويهز عند 90 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة.
  4. باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر ، أعد تعليق المواد العضوية عن طريق سحب ما يصل إلى 10x. أضف مزيج الإنزيم 2 واخلطه جيدا عن طريق السحب باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر. ضع عند 37 درجة مئوية ، 20٪ O2 و 5٪ CO2 ، اهتز عند 90 دورة في الدقيقة لمدة 10-15 دقيقة.
  5. أوقف عملية التفكك عن طريق تعليق محلول الخلية في 10 مل من محلول STOP البارد. قم بتصفية محلول الخلية باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي محلول الخلية المصفى لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية لتشكيل حبيبة.
  6. نضح الوسائط ، وترك حبيبات الخلية وإعادة تعليق الخلايا في 4 مل من البرد 0.04٪ BSA. قم بتصفية محلول الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر وعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  7. الطرد المركزي محلول الخلية لمدة 10 دقائق عند 300 × جم عند 4 درجات مئوية. نضح محلول BSA ، وترك بيليه الخلية. أعد تعليق الخلايا وفقا لدليل مجموعة snRNA-seq القائم على الموائع الدقيقة في وسط NSB +.

3. عزل النوى المفردة عن المواد العضوية

  1. نقل المواد العضوية إلى برنامج تلفزيوني مبرد وقطع كل عضوي إلى 4 قطع. اغسل المواد العضوية 2x باستخدام برنامج تلفزيوني مبرد.
  2. قطع بالمقص طرف ماصة ماصة 1000 ميكرولتر ونقل القطع العضوية إلى حارس 2 مل. نضح PBS تماما وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل NP40.
  3. ارتد 3x مع مدقة dounce A و 3x مع مدقة dounce B. نقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل. اغسل الحارس بمخزن مؤقت إضافي للتحلل NP40 بمقدار 1 مل وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. احتضان لمدة 5 دقائق في RT وبعد ذلك تعليق أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × غرام.
  4. نضح طاف تاركا 50 ميكرولتر من المادة الطافية خلفه. أضف 1 مل من NSB + دون إزعاج الحبيبات. يعاد التعليق بعد 5 دقائق من الحضانة.
  5. تعليق الطبقة أعلى تدرج Percoll (الطبقة السفلية: 1 مل من NSB + و 250 ميكرولتر من Percoll ، الطبقة الوسطى: 1 مل من NSB + و 188 ميكرولتر من Percoll ، الطبقة العليا: 1 مل من NSB + و 125 ميكرولتر من Percoll). (حرجة) قم بإجراء الطبقات بعناية فائقة لتجنب خلط الطبقات.
  6. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية ، نضح طاف وإعادة تعليقه في NSB +. قم بتصفية محلول النوى باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
  7. قم بتلطيخ النوى وعدها باستخدام DAPI وغرفة نيوباور. أعد تعليق النوى وفقا لدليل مجموعة scRNA-seq القائم على الموائع الدقيقة.

4. إعداد المكتبة وتسلسلها

  1. قم بتحميل 10000 خلية ونواة في نظام الموائع الدقيقة وقم بإنشاء المكتبة وفقا لدليل مجموعة scRNA-seq القائمة على الموائع الدقيقة (جدول المواد).
  2. تسلسل المكتبات مع ما يقدر ب 6 × 108 قراءات لكل مكتبة snRNA-seq و 1.6 × 108 قراءات لكل مكتبة scRNA-seq ، مما يؤدي إلى تشبع تسلسل بنسبة 87٪ لمجموعة بيانات snRNA-seq و 36٪ تشبع تسلسل لمجموعة بيانات scRNA-seq.

5. التحليل

  1. إجراء تحليل التسلسل باستخدام خط أنابيب تحليل البيانات ل scRNA-seq و snRNA-seq والمحاذاة مع جينوم GRCh38 البشري. إخضاع مصفوفة العد التي تم إنشاؤها بواسطة خط الأنابيب هذا لمزيد من التحليل باستخدام R-package Seurat (الإصدار 4.1.1)25.
  2. قم بإنشاء كائن Seurat من خلال النظر في الجينات التي تم تمثيلها في 5 خلايا على الأقل ودمج الخلايا التي تحتوي على 300 جين على الأقل. قم بإجراء تصفية إضافية لمراقبة الجودة عن طريق الاحتفاظ بالخلايا التي تحتوي على أكثر من 1000 جين ولكن أقل من 4000 جين لمجموعة بيانات scRNA-seq وأكثر من 800 ، ولكن أقل من 4000 جين لكل نواة لمجموعة بيانات snRNA-seq. استبعاد خلايا مجموعات البيانات والنوى التي تتجاوز 5٪ من قراءات الميتوكوندريا.
  3. للتخفيف من تأثيرات الدفعات بين كلتا الطريقتين ، قم بدمج كل من مجموعات البيانات التي تمت تصفيتها ، وقم بالتطبيع والتصور عبر التقريب والإسقاط المتشعب الموحد (UMAP). حذف المجموعة 1 التي تعرض المعرف الجزيئي الفريد المنخفض (UMI) وعدد الجينات. بعد ذلك ، بالنسبة للمجموعات ، قم بتعيين هويات الخلايا بناء على جينات العلامات المعروفة ومجموعة البيانات العضوية البالغة من العمر 30 يوما من Ana Uzquiano et. (ملف الترميز التكميلي 1)18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للتحقيق في تكوين نوع الخلية من عضويات الدماغ باستخدام scRNA-seq و snRNA-seq ، تم حصاد عضويات الدماغ بعد 30 يوما من الثقافة حيث تظهر الكائنات العضوية في هذه المرحلة بالفعل حلقات ظهارية عصبية تتكون من أسلاف محاطة بأسلاف وسيطة وخلايا عصبية في مرحلة مبكرة 4,18. تعد مراقبة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

برز التحليل النسخي للخلايا المفردة والنوى المفردة كأداة محورية لفهم الآليات التنظيمية الجينية داخل الأنسجة المعقدة. كلتا الطريقتين تمكن من دراسات النسخ من عضويات الدماغ. لضمان تجربة ناجحة بشكل عام ، تكون جودة المواد الأولية ذات أهمية عالية. لذلك ، من الضروري قطع المواد العضوية بانتظام ل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر فاليريا فرنانديز فالون على التعليمات الأصلية لمجموعة Miltenyi Neural Disdisation. نشكر أيضا منصة تكنولوجيا الجينوم الخاصة ب Max Delbrueck Centrum على توفير وصفة المخزن المؤقت للتحلل NP40 والمشورة القيمة لإعداد هذا البروتوكول. كما نشكر مارغريتا هيرتسوغ وألكسندرا تشيرنيشيف على الدعم التنظيمي للمختبر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715(2015).
  3. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
  6. Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929(2021).
  7. Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169(2021).
  8. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  9. Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
  10. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  11. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312(2022).
  12. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  13. Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
  14. Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
  15. Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
  16. Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
  17. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
  18. Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
  19. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).
  20. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  21. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  22. Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694(2021).
  23. Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
  24. Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213(2023).
  25. Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
  26. Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350(2021).
  27. Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
  28. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  29. Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339(2022).
  30. Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved