مجموعة من التنسيقات الوسيطة المحاكية المستنيرة في الموقع لزراعة الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية المكتسبة بيئيا

Summary

تركز هذه الورقة على تفصيل أفضل الممارسات لصنع الوسائط للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية الحساسة المكتسبة من البيئة. تساعد هذه الطرق في إدارة الثقافات اللاهوائية ويمكن تطبيقها لدعم نمو الكائنات الحية الدقيقة غير المستزرعة المراوغة ، "المادة المظلمة الميكروبية".

Abstract

تعتمد الأبحاث المعتمدة على الثقافة للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية على الكفاءة المنهجية. يجب أن تخلق هذه الطرق وتحافظ على ظروف نمو مناسبة (على سبيل المثال ، الأس الهيدروجيني ومصادر الكربون) للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية مع السماح أيضا باستخراج العينات دون المساس بالبيئة الاصطناعية. وتحقيقا لهذه الغاية ، يمكن أن تكون الطرق التي تسترشد ببيئة في الموقع وتحاكيها ذات فائدة كبيرة في استزراع الكائنات الحية الدقيقة من تلك البيئة. هنا ، نحدد طريقة لاهوائية مستنيرة ومحاكاة في الموقع لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الأرضية وتحت السطحية ، مع التركيز على جمع العينات اللاهوائية بأقل قدر من الاضطراب. يوضح هذا البروتوكول تفاصيل إنتاج وسط سائل لاهوائي قابل للتخصيص ، والاستحواذ البيئي والنمو في المختبر للكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية. ويغطي البروتوكول أيضا المكونات الحاسمة لمفاعل حيوي لاهوائي يستخدم في المحاكاة البيئية للرواسب والوسائط السائلة اللاهوائية للمزارع المكتسبة بيئيا. لقد قمنا بتضمين بيانات تسلسل الجيل التالي الأولية من ميكروبيوم تمت صيانته على مدار عمر مفاعل حيوي حيث تم تعديل الثقافة النشطة ديناميكيا استجابة لمصدر تجريبي للكربون.

Introduction

معظم الكائنات الحية الدقيقة لا تزال غير مستزرعة. ويدعم ذلك التباين الكبير بين الخلايا التي لوحظت من خلال الفحص المجهري على النقيض من الكائنات الحية الدقيقة القليلة التي تم استزراعها بنجاح باستخدام ألواح أجار. أطلق ستالي وكونوبكا على هذا التفاوت اسم "شذوذ عدد الصفائح العظيم"¹. يتم دعم التنوع المقدر غير المحسوب من خلال البيانات الميتاجينومية والميتاترانسكريبتومية التي تظهر العديد من الأجناس الجديدة الموزعة في منحنيات وفرة الرتبة من عدة بيئات مختلفة². تمت الإشارة إلى الكائنات الحية الدقيقة التي لوحظت (بشكل عام عن طريق التسلسل العشوائي للبندقية لمجتمع ميكروبي) ولكن لم يتم استزراعها باسم "المادة المظلمة ....

Protocol

1. إنتاج وسط سائل لاهوائي قابل للتخصيص

1. متوسطة لزجاجات الثقافة (إنتاج 500 مل)
   1. قم بقياس وإضافة مركبات إلى زجاجة سعة 1 لتر واضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام العمود الموجود في الجدول 1 المقابل لثقافة اهتمام القارئ (يتم تسجيل الكميات الواردة في الجدول 1 لإنتاج 1000 مل ، واضبطها وفقا لذلك). امزج المركبات مع التجانس عن طريق تحريك الزجاجة.
   2. سخني السائل حتى الغليان عن طريق تسخين الزجاجة في الميكروويف لمدة 5-6 دقائق. افتح الميكروويف كثيرا وقم بتدوير السائل برفق باستخدام قفاز مقاوم للحرارة. افتح الميكروويف بسرعة إذا ظل السائل ثابتا بعد الفقاعات ؛ خلاف ذلك ، قد يتوسع السائل بسرعة ويفيض الزجاجة.

النتائج

نعرض هنا نتائج دراسة المفاعل الحيوي باستخدام طريقة تحضير وسط ثقافة البئر المختلطة وطريقة إعداد المفاعل الحيوي كما هو موضح هنا. تم تعديل وسط الاستزراع المختلط للبئر ليحتوي كمصدر للكربون على ملاط من مكعبات الذرة المعالجة بواسطة الذوبان الحراري المائي التأكسدي (OHD) ^13,14

Discussion

يدين قسم الإنتاج المتوسط من هذا البروتوكول (القسم 1) بهيكله إلى تقنية Hungate المعدلة ل Miller and Wolin¹⁷ ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع منذ نشرها. يأتي التطبيق العملي لهذا البروتوكول الموسع من طبيعته الوصفية واقترانه باكتساب الكائنات الحية الدقيقة في الموقع . تم استخدام زجاجات .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's