A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولات تمكن من عزل الخلايا اللحمية من عظم الفئران ونخاع العظام والغدة الصعترية وأنسجة الغدة الصعترية البشرية المتوافقة مع تعدد الخلايا أحادي الخلية.

Abstract

مكن تسلسل الخلية الواحدة من رسم خرائط لمجموعات الخلايا غير المتجانسة في سدى الأعضاء المكونة للدم. توفر هذه المنهجيات عدسة يمكن من خلالها دراسة عدم التجانس الذي لم يتم حله سابقا في حالة مستقرة ، وكذلك التغيرات في تمثيل نوع الخلية الناجم عن الضغوط الخارجية أو أثناء الشيخوخة. هنا ، نقدم بروتوكولات تدريجية لعزل مجموعات الخلايا اللحمية عالية الجودة من الفئران والغدة الصعترية البشرية ، وكذلك عظام الفئران ونخاع العظام. الخلايا المعزولة من خلال هذه البروتوكولات مناسبة لإنشاء مجموعات بيانات متعددة الخلايا أحادية الخلية عالية الجودة. تتم مناقشة تأثيرات هضم العينات ، واستنفاد سلالة المكونة للدم ، وتحليل / فرز FACS ، وكيف تؤثر هذه العوامل على التوافق مع تسلسل الخلية الواحدة هنا. مع أمثلة على ملامح FACS التي تشير إلى تفكك ناجح وغير فعال وإنتاجية الخلايا اللحمية النهائية في تحليل ما بعد التسلسل ، يتم توفير مؤشرات يمكن التعرف عليها للمستخدمين. يعد النظر في المتطلبات المحددة للخلايا اللحمية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار يمكن أن تعزز المعرفة في هذا المجال.

Introduction

في البالغين الأصحاء ، يحدث إنتاج دي نوفو لخلايا الدم في نخاع العظام والغدة الصعترية. الخلايا اللحمية في هذه المواقع ضرورية للحفاظ على تكون الدم ، لكن السدى يشكل أقل من 1٪ من الأنسجة1،2،3،4. وبالتالي ، فإن الحصول على عزلات نقية من السدى الداعمة لتكوين الدم يشكل تحديا كبيرا ، خاصة بالنسبة للخلايا المتعددة أحادية الخلية التي تتطلب معالجة مناسبة للحصول على عينات عالية الجودة. قد تتداخل مكونات كوكتيلات الهضم المختلفة مع خطوات معينة في تحليل multiomics 5,6. توضح البروتوكولات المعروضة هنا ب....

Protocol

تم إجراء جميع الأعمال مع الأنسجة البشرية بعد موافقة مجلس المراجعة الداخلية لمستشفى ماساتشوستس العام (IRB). تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بمستشفى ماساتشوستس العام (IACUC). تم استخدام الفئران C57Bl / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع ، وكل من الذكور والإناث ، في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. إعداد أنسجة الغدة الصعترية الفئران

  1. قم بإعداد المخازن المؤقتة والحلول التالية.
    1. متوسط 199 (M199) مع 2٪ (v / v) مصل بقري جنيني (FBS) (انظر جدول المواد).
    2. كوكتيل تفكك الفئران: 0.5 WU / mL Libera....

النتائج

تنتج هذه البروتوكولات أنواعا من الخلايا اللحمية القابلة للتكرار من الغدة الصعترية ونخاع العظم مناسبة لتحليل التدفق الخلوي ، بالإضافة إلى تعدد الخلايا أحادية الخلية ، مثل تسلسل scRNA. يخضع نسيج الغدة الصعترية للفأر لعملية إعادة تشكيل كبيرة استجابة للضغوط ، مثل التكييف السام للخلايا الذي يس.......

Discussion

تعتبر الخلايا اللحمية في الأعضاء المكونة للدم ضرورية لإنتاج الدم الطبيعي ويمكن أن تؤدي اضطرابات السدى المكونة للدم إلى إعاقات شديدة في صيانة المكونة للدم والاستجابة للإجهاد9،23،24. نظرة ثاقبة على الخلايا اللحمية المكونة للدم أمر ضروري لف.......

Disclosures

دي تي إس هو مدير ومساهم في أجيوس ثيرابيوتكس وإيديتاس للأدوية. مؤسس ومدير ومساهم وعضو مجلس استشاري علمي لشركة Magenta Therapeutics و LifeVault Bio ، ومساهم ومؤسس Fate Therapeutics و Garuda Therapeutics ، ومدير ومؤسس ومساهم في Clear Creek Bio ، ومستشار لشركة FOG Pharma و Inzen Therapeutics و VCanBio ، وحاصل على تمويل بحثي برعاية من Sumitomo Dianippon. D.T.S و K.G مخترعان US20220143099A1 براءات الاختراع.

Acknowledgements

لقد تم دعمنا بمساعدة فنية متخصصة من قبل مرفق قياس التدفق الخلوي HSCI-CRM في مستشفى ماساتشوستس العام ومرفق باور الأساسي في جامعة هارفارد. تم دعم T.K و K. G من قبل مجلس البحوث السويدي و CM من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية. نشكر سيرجي إيساييف و I-Hsiu Lee على المساعدة في تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycin D)BD Biosciences559925
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITCBD Biosciences643510
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 miceJackson664Males or females, 8-12 weeks old
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Collagenase IVMillipore SigmaC5138
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µmFisher Scientific08-771-2
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)Biolegend422801
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083 2500 U/mL
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kitStemCell Technologies19860
Fetal Bovine SerumGibcoA31605-01Qualified One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Mouse anti-human CD235a-BV77BD Biosciences740785
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Mouse anti-human CD45-BV77Biolegend304050
Mouse anti-human CD4-BV605BD Biosciences562658
Mouse anti-human CD66b-FITCBD Biosciences555724
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Mouse anti-human EpCam-BV421Biolegend324220
Protector RNase InhibitorMillipore Sigma3335402001
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-mouse CD11b-BiotinBiolegend101204
Rat anti-mouse CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-mouse CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-mouse CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-mouse CD3-BiotinBiolegend100244
Rat anti-mouse CD45.2-BiotinBiolegend109804
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-mouse CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-mouse CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-mouse EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend108404
Rat anti-mouse Ter119-BiotinBiolegend116204
Rat anti-mouse Ter119-PEBiolegend116208
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiochemicalLS004107

References

  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induc....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

FACS Multiomics

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved