A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
نقدم هنا بروتوكولات تمكن من عزل الخلايا اللحمية من عظم الفئران ونخاع العظام والغدة الصعترية وأنسجة الغدة الصعترية البشرية المتوافقة مع تعدد الخلايا أحادي الخلية.
مكن تسلسل الخلية الواحدة من رسم خرائط لمجموعات الخلايا غير المتجانسة في سدى الأعضاء المكونة للدم. توفر هذه المنهجيات عدسة يمكن من خلالها دراسة عدم التجانس الذي لم يتم حله سابقا في حالة مستقرة ، وكذلك التغيرات في تمثيل نوع الخلية الناجم عن الضغوط الخارجية أو أثناء الشيخوخة. هنا ، نقدم بروتوكولات تدريجية لعزل مجموعات الخلايا اللحمية عالية الجودة من الفئران والغدة الصعترية البشرية ، وكذلك عظام الفئران ونخاع العظام. الخلايا المعزولة من خلال هذه البروتوكولات مناسبة لإنشاء مجموعات بيانات متعددة الخلايا أحادية الخلية عالية الجودة. تتم مناقشة تأثيرات هضم العينات ، واستنفاد سلالة المكونة للدم ، وتحليل / فرز FACS ، وكيف تؤثر هذه العوامل على التوافق مع تسلسل الخلية الواحدة هنا. مع أمثلة على ملامح FACS التي تشير إلى تفكك ناجح وغير فعال وإنتاجية الخلايا اللحمية النهائية في تحليل ما بعد التسلسل ، يتم توفير مؤشرات يمكن التعرف عليها للمستخدمين. يعد النظر في المتطلبات المحددة للخلايا اللحمية أمرا بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة وقابلة للتكرار يمكن أن تعزز المعرفة في هذا المجال.
في البالغين الأصحاء ، يحدث إنتاج دي نوفو لخلايا الدم في نخاع العظام والغدة الصعترية. الخلايا اللحمية في هذه المواقع ضرورية للحفاظ على تكون الدم ، لكن السدى يشكل أقل من 1٪ من الأنسجة1،2،3،4. وبالتالي ، فإن الحصول على عزلات نقية من السدى الداعمة لتكوين الدم يشكل تحديا كبيرا ، خاصة بالنسبة للخلايا المتعددة أحادية الخلية التي تتطلب معالجة مناسبة للحصول على عينات عالية الجودة. قد تتداخل مكونات كوكتيلات الهضم المختلفة مع خطوات معينة في تحليل multiomics 5,6. توضح البروتوكولات المعروضة هنا ب....
تم إجراء جميع الأعمال مع الأنسجة البشرية بعد موافقة مجلس المراجعة الداخلية لمستشفى ماساتشوستس العام (IRB). تم إجراء جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بمستشفى ماساتشوستس العام (IACUC). تم استخدام الفئران C57Bl / 6 ، التي تتراوح أعمارها بين 8 و 10 أسابيع ، وكل من الذكور والإناث ، في هذه الدراسة. تم الحصول على من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
1. إعداد أنسجة الغدة الصعترية الفئران
تنتج هذه البروتوكولات أنواعا من الخلايا اللحمية القابلة للتكرار من الغدة الصعترية ونخاع العظم مناسبة لتحليل التدفق الخلوي ، بالإضافة إلى تعدد الخلايا أحادية الخلية ، مثل تسلسل scRNA. يخضع نسيج الغدة الصعترية للفأر لعملية إعادة تشكيل كبيرة استجابة للضغوط ، مثل التكييف السام للخلايا الذي يس.......
تعتبر الخلايا اللحمية في الأعضاء المكونة للدم ضرورية لإنتاج الدم الطبيعي ويمكن أن تؤدي اضطرابات السدى المكونة للدم إلى إعاقات شديدة في صيانة المكونة للدم والاستجابة للإجهاد9،23،24. نظرة ثاقبة على الخلايا اللحمية المكونة للدم أمر ضروري لف.......
دي تي إس هو مدير ومساهم في أجيوس ثيرابيوتكس وإيديتاس للأدوية. مؤسس ومدير ومساهم وعضو مجلس استشاري علمي لشركة Magenta Therapeutics و LifeVault Bio ، ومساهم ومؤسس Fate Therapeutics و Garuda Therapeutics ، ومدير ومؤسس ومساهم في Clear Creek Bio ، ومستشار لشركة FOG Pharma و Inzen Therapeutics و VCanBio ، وحاصل على تمويل بحثي برعاية من Sumitomo Dianippon. D.T.S و K.G مخترعان US20220143099A1 براءات الاختراع.
لقد تم دعمنا بمساعدة فنية متخصصة من قبل مرفق قياس التدفق الخلوي HSCI-CRM في مستشفى ماساتشوستس العام ومرفق باور الأساسي في جامعة هارفارد. تم دعم T.K و K. G من قبل مجلس البحوث السويدي و CM من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية. نشكر سيرجي إيساييف و I-Hsiu Lee على المساعدة في تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
7AAD (7-aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559925 | |
Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC | BD Biosciences | 643510 | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9647 | |
C57Bl/6 mice | Jackson | 664 | Males or females, 8-12 weeks old |
Calcein | Fisher Scientific | 65-0853-78 | |
Collagenase IV | Millipore Sigma | C5138 | |
Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Biolegend | 422801 | |
Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
Dnase I Solution | Thermo Fisher Scientific | 90083 | 2500 U/mL |
Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit | StemCell Technologies | 19860 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A31605-01 | Qualified One Shot |
Human Fc Block | BD Biosciences | 564220 | |
Liberase TM | Millipore Sigma | 5401127001 | Research Grade |
Medium 199 | Gibco | 12350 | |
Mouse anti-human CD235a-BV77 | BD Biosciences | 740785 | |
Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594 | Biolegend | 303130 | |
Mouse anti-human CD45-BV77 | Biolegend | 304050 | |
Mouse anti-human CD4-BV605 | BD Biosciences | 562658 | |
Mouse anti-human CD66b-FITC | BD Biosciences | 555724 | |
Mouse anti-human CD8-APC/Cy7 | BD Biosciences | 557760 | |
Mouse anti-human EpCam-BV421 | Biolegend | 324220 | |
Protector RNase Inhibitor | Millipore Sigma | 3335402001 | |
Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594 | Biolegend | 120424 | |
Rat anti-mouse CD11b-Biotin | Biolegend | 101204 | |
Rat anti-mouse CD140a-APC | Fisher Scientific | 17-1401-81 | |
Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | |
Rat anti-mouse CD31-BUV737 | BD Biosciences | 612802 | |
Rat anti-mouse CD31-BV421 | Biolegend | 102424 | |
Rat anti-mouse CD3-Biotin | Biolegend | 100244 | |
Rat anti-mouse CD45.2-Biotin | Biolegend | 109804 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7 | Biolegend | 103114 | |
Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin | Biolegend | 103204 | |
Rat anti-mouse CD51-PE | Biolegend | 104106 | |
Rat anti-mouse EpCam-BV711 | BD Biosciences | 563134 | |
Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700 | Biolegend | 108142 | |
Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin | Biolegend | 108404 | |
Rat anti-mouse Ter119-Biotin | Biolegend | 116204 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE | Biolegend | 116208 | |
Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7 | Biolegend | 116222 | |
Stemxyme | Worthington Biochemical | LS004107 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved