مورين اليسار الرئوي هيلار المشبك نموذج من إصابة نقص تروية الرئة

Summary

يحدد البروتوكول طريقة مجدية وموثوقة وقابلة للتكرار لقط النقيض الرئوي الأيسر والتي يمكن استخدامها لدراسة إصابة نقص تروية الرئة في نماذج الفئران.

Abstract

تعد إصابة نقص التروية (IRI) أثناء زراعة الرئة عامل خطر رئيسي لمضاعفات ما بعد الزرع ، بما في ذلك خلل الكسب غير المشروع الأولي والرفض الحاد والمزمن والوفيات. أدت الجهود المبذولة لدراسة أسس IRI إلى تطوير نموذج فأر موثوق به وقابل للتكرار لقط الهيلار في الرئة اليسرى. يتضمن هذا النموذج إجراء جراحيا يتم إجراؤه في فأر مخدر وتنبيب. يتم إجراء بضع الصدر الأيسر ، يليه تعبئة الرئة بعناية وتشريح الهيلوم الرئوي الأيسر. يتضمن المشبك النقيري ربط خياطة عكسية للهيلوم الرئوي مع عقدة منزلقة ، مما يوقف التدفق الشرياني والتدفق الوريدي وتدفق الهواء عبر القصبات الهوائية الرئيسية اليسرى. يبدأ التروية عن طريق الإزالة الدقيقة للخياطة. يستخدم مختبرنا 30 دقيقة من نقص التروية و 1 ساعة من التروية للنموذج التجريبي في التحقيقات الحالية. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذه الفترات الزمنية اعتمادا على السؤال التجريبي المحدد. مباشرة قبل التضحية ، يمكن الحصول على غازات الدم الشرياني من البطين الأيسر بعد فترة 4 دقائق من تثبيت الظهيرة اليمنى لضمان أن قيم PaO₂ التي تم الحصول عليها تعزى إلى الرئة اليسرى المصابة وحدها. كما وصفنا طريقة لقياس تسرب الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يتضمن الحقن في الوريد لجسم مضاد يحمل علامة الفلوروكروم خاص بالخلية (الخلايا) المراد دراستها قبل التضحية. يمكن بعد ذلك حصاد الرئة اليسرى لقياس التدفق الخلوي ، وتجميدها أو تثبيتها ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية المضمنة في البارافين ، وتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي. تسمح تقنية المشبك النقيري هذه بدراسة مفصلة للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء IRI. تكشف النتائج التمثيلية عن انخفاض أكسجة الرئة اليسرى والأدلة النسيجية لإصابة الرئة بعد لقط النقيري. يمكن تعلم هذه التقنية بسهولة واستنساخها من قبل الأفراد ذوي الخبرة في الجراحة المجهرية أو بدونها ، مما يؤدي إلى نتائج موثوقة ومتسقة ويعمل كنموذج يمكن اعتماده على نطاق واسع لدراسة IRI للرئة.

Introduction

IRI أثناء زرع الأعضاء هو عامل خطر رئيسي لخلل الكسب غير المشروع الأولي والحلقات اللاحقة من رفض الكسب غير المشروع ^1,2. أثناء الزرع ، يتم تعريف وقت نقص التروية الدافئ على أنه الفترة الزمنية من المشبك الأبهري المتبرع إلى بدء التروية الباردة ومن إزالة الأعضاء من الثلج إلى زرع الأعضاء. يتم تعريف وقت التخزين البارد على أنه الفترة الزمنية من بداية التروية الباردة إلى إزالة العضو من الجليد³. نقص التروية الدافئ أكثر ضررا لوظيفة الأعضاء اللاحقة من نقص التروية الباردة^4،5،6 ، وآلياته الأساسية تتطلب مزيدا من الدراسة في النماذج قبل السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط زرع الأعضاء من التبرع بعد الموت القلبي (DCD) بأوقات إقفارية دافئة أطول من التبرع التقليدي بعد الموت الدماغي (DBD)⁷. في حين أن استخدام المتبرعين بأمراض DCD يمكن أن يوسع مجموعة المتبرعين ويزيد من استخدام الرئة ، إلا أن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات قبل السريرية لتقييم آثار نقص التروية الدافئ على وظائف الرئة بعد الزرع. أدناه ، وصفنا نموذجا ل IRI الدافئ في الفئران عبر مشبك النقيض الرئوي الأيسر.

تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لقط الهيلار الرئوي وتكييفها على مدى السنوات العديدة الماضية وقد تشمل استخدام مشبك الأوعية الدموية الدقيقة الرضحية^{8،9،10،11،12،13} ، عاصبة روميل^14،15 ، أو ربط خياطة¹⁶ كما المشبك هيلار. جوهر المشبك النقيري هو أنه يجب أن يكون قابلا للانعكاس ويسبب ضررا ضئيلا أو معدوما لهياكل النقيض بحيث يمكن تحقيق التروية. هنا ، نصف تقنية المشبك النقيري في الفئران التي تتضمن ربط خياطة عكسية للهيلوم الرئوي الأيسر مع عقدة منزلقة. تسد هذه الطريقة تدفق الشرايين الرئوية والتدفق الوريدي وتدفق الهواء داخل وخارج القصبات الهوائية الرئيسية. الفائدة الرئيسية للعقدة المنزلقة فوق مشبك الأوعية الدموية أو المشبك أو العاصبة هي أنه يمكن إغلاق الصدر خلال فترات طويلة من نقص التروية ، وبالتالي تقليل السوائل غير المعقولة وفقدان الحرارة في الماوس. نحن نقدم بروتوكولا للحصول على قياسات موثوقة لغازات الدم الشرياني (ABG) ولقياس تسرب الخلايا بعد تثبيت النقيري.

تحتل تقنية المشبك النقيري هذه مكانة مهمة في الدراسة الأوسع لزراعة الرئة. بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الصغيرة لزراعة الرئة التقويمية ، يمكن لتقنية المشبك النقيضي عزل آثار IRI دون إضافة صدمة مفاغرة جراحية أو خيفية¹⁷. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إتقان تقنية المشبك النقيضي بسهولة وسرعة أكبر من عملية زرع رئة الفأر. في الواقع ، باستخدام تقنيات المشبك النقيضي ، تم تحديد العديد من الآليات المهمة في التسبب في IRI في العقد الماضي ، مثل TLR4 و NADPH oxidase ومستقبلات الأدينوزين A2A^{14،18،19،20}. في البروتوكول التالي ، نقدم طريقة موثوقة وقابلة للتعليم وقابلة للتكرار لقط النقيض كأداة لدراسة IRI للرئة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية الطب بجامعة واشنطن. تلقت رعاية إنسانية وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر^{، الطبعة} 8²¹ التي أعدتها الأكاديمية الوطنية للعلوم ونشرتها المعاهد الوطنية للصحة ، ومبادئ رعاية المختبر التي صاغتها الجمعية الوطنية للبحوث الطبية.

1. التخدير والتنبيب

1. حدد ماوسا يزن 25 جراما على الأقل. سيسهل ذلك التنبيب بسهولة بسبب الفتحة الأكبر بين الحبال الصوتية.
2. حقن الفأر داخل الصفاق بمزيج من الكيتامين (جرعة 100 ملغم / كغم من وزن الجسم) والزيلازين (جرعة 10 ملغم / كغم من وزن الجسم). يجب تحميل هذا الخليط في حقنة 1/2 سم مكعب بإبرة 1/2 بوصة 29 جرام. انتظر حوالي 5 دقائق حتى يصبح الكيتامين ساري المفعول - يجب ألا يظهر الماوس حركة عفوية ولا يستجيب لقرص إصبع القدم ، مما يؤكد التخدير الكافي.
3. حقن البوبرينورفين (جرعة 0.05 ملغم / كغم من وزن الجسم) تحت الجلد قبل الجراحة للسيطرة على الألم بشكل إضافي.
4. ضع مرهم العيون غير الدوائي على كلتا العينين لتجنب جفاف القرنية أثناء الجراحة.
5. حلق الماوس باستخدام مقص على الصدر الأيسر والظهر (انظر الشكل 1 أ) ، وامتد إلى البطن إذا تم التخطيط لبضع البطن (انظر الخطوة 5.3).
6. بمجرد تخدير الفأر ، قم بإجراء التنبيب باستخدام إعداد التنبيب المفضل وبقية الإجراء تحت المجهر فوق حصيرة دافئة عند ~ 37 درجة مئوية (للحفاظ على الحرارة الطبيعية في الماوس).
7. بعد تحقيق رؤية كافية للحبال الصوتية ، أدخل مقدمة محلية الصنع (انظر الشكل التكميلي 1) مع منحنى في النهاية في قسطرة وعائية مقاس 1 بوصة 20 جيجا ، والتي تستخدم كأنبوب القصبة الهوائية (ETT). قم بتوجيه طرف المقدم ثم ETT بين الحبال الصوتية وتجاوزها.
   ملاحظة: من المهم تصور أن ETT يمر عبر الحبال الصوتية لتجنب التنبيب الخاطئ في المريء. يجب توخي الحذر لتجنب إصابة الحبال الصوتية أثناء التنبيب (أي يجب أن يقتصر عدد محاولات التنبيب على 5 ويجب عدم تقدم ETT إذا تم استيفاء المقاومة).
8. بمجرد إدخال ETT ، قم بإزالة المقدم ، وقم بتوصيل ETT بجهاز تهوية للحيوانات الصغيرة. مراقبة ارتفاع الصدر المتماثل لتأكيد التنبيب الرغامي الصحيح. يجب أن تكون إعدادات جهاز التنفس الصناعي 100-105 نفسا في الدقيقة وجزءا من الأكسجين المستوحى بنسبة 100٪. حجم المد والجزر 0.35 مل وضغط الزفير النهائي الإيجابي هو 1 سم H₂O.
   ملاحظة: تأكد من أن الصدر بدلا من البطن يرتفع لأن التنبيب المريئي العرضي سيؤدي إلى الوفاة إذا لم يتم تصحيحه على الفور.
9. بمجرد التأكد من وجوده في موضعه ، قم بتأمين ETT بشريط حريري 5 سم من شريط حريري 1 بوصة حول أنف الماوس ، مما يضمن الاتصال الكافي مع ETT والأنف حتى لا ينزلق ETT من الفم (انظر الشكل 1B-C).
10. للحفاظ على التخدير الكافي طوال الجراحة ، يتم تطبيق 1٪ -1.5٪ إيزوفلوران بما يتماشى مع تدفق الأكسجين.

2. بضع الصدر

1. ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، مع تسجيل كلا الكفوف الأمامية في الزاوية اليسرى العليا ، والمخلب الخلفي الأيمن مثبت في الزاوية اليسرى السفلية ، والمخلب الخلفي الأيسر مثبت على الزاوية اليمنى السفلية (انظر الشكل 2G للتسجيل).
2. تطهير مع الجلد على الصدر الأيسر مع ما لا يقل عن 3 جولات بالتناوب من اليود البوفيدون تليها 70 ٪ تطبيق الكحول.
3. قم بإجراء شق على^{الفضاء الوربي} الرابع من الخط الإبطي الأمامي إلى الخط الإبطي الخلفي ، باستخدام المقص لفتح الجلد المغطي (انظر الشكل 2 أ). يقع الفضاء الوربي 4 حوالي 1 سم تحت الإبط في منتصف خط الإبط.
4. لتقليل فقدان الدم ، قم بتخثر الأوعية الدموية المرئية داخل الطبقات تحت الجلد والعضلات باستخدام قلم كي محمول باليد.
5. قسم العضلات الظهرية العريضة والعضلات الأمامية المسننة بحدة باستخدام مقص على طول شق الجلد (انظر الشكل 2 ب).
6. باستخدام ملقط منحني ناعم ، ارفع^الضلع الرابع بعناية (مع الحرص على عدم إصابة الرئة الأساسية) وقم بعمل قصاصة دقيقة بمقص ناعم^{فوق الضلع} 5 مباشرة لدخول^{الفضاء الوربي} الرابع (انظر الشكل 2 ج). قم بإجراء بضع الصدر^{فوق الضلع} 5 بدلا من^{أسفل الضلع} 4 لتجنب إصابة الحزمة الوعائية العصبية الوربية.
7. بمجرد فقدان ضغط التجويف الجنبي السلبي وتراجع الرئة بعيدا عن جدار الصدر ، قم بتمديد بضع الصدر الأمامي والخلفي في الفضاء الوربي 4^{فوق الضلع} 5 (انظر الشكل 2D-E). يجب أن يكون طول الشق بالكامل طويلا بما يكفي لكشف الرئة بأكملها ، عادة ~ 1 سم.
   ملاحظة: يمكن أن يحدث نزيف الشريان الثديي الداخلي إذا تم تمديد بضع الصدر بعيدا جدا إلى الأمام - إذا واجهت ، يجب أن يتم كي هذا لتجنب فقدان الدم المفرط.
8. ضع اثنين من مبعدات الضلع لنشر مساحة الضلع ، مما يسمح بنافذة عمل لا تقل عن 1 سم² للتصور الكافي (انظر الشكل 2F-G).

3. تطبيق المشبك هيلار

1. باستخدام أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية مدببة ، قم بتعبئة الرئة اليسرى عن طريق رفعها رأسيا ثم تقسيم الرباط الرئوي السفلي الشفاف بصراحة (انظر الشكل 3A-B).
   ملاحظة: إذا كان من الصعب القيام بذلك دون تمزق الرئة ، فيمكن أيضا تقسيم الرباط الرئوي السفلي بشكل حاد باستخدام مقص دقيق.
2. تعكس الرئة من الأمام بحيث يمكن تصور الهيلوم الرئوي الأيسر الخلفي. قطع قطعة من ربطة عنق الحرير 6-0 إلى ~ 10 سم ووضع نقطة المنتصف من هذا التعادل الخلفي إلى hilum (انظر الشكل 3C).
3. بعد ذلك ، اقلب الرئة اليسرى للخلف لوضعها فوق ربطة العنق واسحب طرفي ربطة العنق إلى الأمام (انظر الشكل 3 د).
4. مع الطرفين الحرين (A و B) من ربطة العنق ، قم بربط عقدة انزلاقية قابلة للانعكاس بالملقط ومشبك البعوض المنحني. انظر الوصف التفصيلي في الخطوتين 3.4.1 و 3.4.2. يبدأ الوقت الإقفاري الدافئ عند ربط العقدة. يجب ألا تنتفخ الرئة اليسرى مع كل نفس لجهاز التنفس الصناعي بمجرد ربط العقدة. يجب أن يصبح أبيض شاحب يعني وقف التروية.
   ملاحظة: يجب توخي الحذر للتأكد من أن العقدة تقع في منتصف الهيلوم ، وتجنب اصطدام الأذين الأيسر عن غير قصد مركزيا وحمة الرئة بشكل جانبي (انظر الشكل 3F).
   1. باستخدام المشبك في اليد المهيمنة والملقط في اليد غير المهيمنة ، أمسك نهاية A بالملقط وقم بلف نقطة منتصف A حول المشبك المغلق مرة واحدة (انظر الشكل 3E).
   2. أمسك نقطة منتصف B بالمشبك واسحبه بكلتا يديك لربط العقدة. لا تدع نهاية B تسحب من خلال العقدة ، مما يجعل العقدة لا رجعة فيها. بعد ربط العقدة ، يجب أن يكون ل B حلقة منبثقة من العقدة ، بينما يجب أن تكون A مستقيمة (انظر الشكل 3F). يمكن تحرير العقدة عن طريق سحب نهاية B.
5. تأكد من الانسداد الكافي للقصبات الهوائية عن طريق سد أنبوب التدفق الخارجي يدويا من ETT إلى جهاز التنفس الصناعي ، مما يؤدي إلى عدم انتفاخ الرئة اليسرى (انظر الشكل 3G). يفترض انسداد الأوعية الدموية مع انسداد الشعب الهوائية نظرا لزيادة انهيار الشريان الرئوي والأوردة مقارنة بالشعب الهوائية الغضروفية.
6. بعد تطبيق المشبك النقيري ، أغلق شق الجلد بغرزة واحدة بسيطة متقطعة باستخدام خياطة نايلون 6-0 ، لتقليل فقد السوائل غير المعقول خلال فترة نقص التروية الدافئة.

4. الافراج عن المشبك هيلار

1. بعد الفترة المرغوبة من نقص التروية الدافئة ، حرر العقدة عن طريق سحب الطرف الحر القصير لربطة العنق الحريرية برفق (B من الشكل 3F والخطوة 3.4). ابدأ وقت إعادة التروية عند تحرير العقدة المنزلقة.
   ملاحظة: بعد تحرير ربطة العنق ، يمكن تأكيد تهوية الرئة عن طريق الانسداد اليدوي مرة أخرى لتدفق ETT ، والذي يجب أن يتسبب الآن في تمدد الرئة اليسرى. مرة أخرى ، يتم تضمين التروية مع تضخم الرئة ، ومع ذلك ، يمكن أيضا تأكيده من خلال زيادة لون الرئة (انظر الشكل 4 أ).
2. خلال فترة إعادة التروية ، أغلق الصدر في ثلاث طبقات لتقليل الخسائر غير المعقولة. أولا ، أغلق^{مساحة الضلع} الرابع بغرزة واحدة بخياطة من النايلون 6-0 ، مع لدغة واحدة^{فوق الضلع} الرابع مباشرة ولدغة واحدة^{فوق الضلع} السادس مباشرة (انظر الشكل 4B-C). اربط هذا عند الحد الأقصى لتضخم الرئة ، لتقليل خطر استرواح الصدر علاجي المنشأ (انظر الشكل 4D-E).
3. بعد ذلك ، أغلق طبقة العضلات باستخدام غرزة جري بسيطة مع خياطة 6-0 نايلون.
4. أخيرا ، أغلق شق الجلد بغرزة بسيطة متقطعة بخياطة 6-0 نايلون (انظر الشكل 4F). تجنب تشغيل الغرز على الجلد بسبب خطر التقاط المستيقظة في شقها وتؤدي إلى تفكك الجرح بالكامل.
5. من هذه النقطة ، يمكن حصاد الرئة مباشرة في نهاية وقت التروية المطلوب. إذا كان تقييم ABG مطلوبا، فراجع الخطوة 5. إذا كانت هناك حاجة إلى حقن إضافي في الوريد قبل التضحية ، فراجع الخطوة 6. هذه جراحة نهائية.
6. إذا كان المقصود من وقت إعادة التروية أن يكون أكبر من ساعتين ، فقم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران للسماح للماوس بالاستيقاظ من التخدير ونزع الأنابيب. تشمل معايير نزع الأنبوب الوخز بقرصة مخلب والتنفس والحركة التلقائية. عادة ما يستغرق إيقاظ الفأر من الكيتامين والتخدير إيزوفلوران 30-45 دقيقة. هذه هي جراحة البقاء على قيد الحياة.
   1. لجراحة البقاء على قيد الحياة ، حقن 1 مل من المحلول الملحي الدافئ تحت الجلد لحساب فقدان السوائل من الجراحة. حقن البوبرينورفين (جرعة 0.05 - 0.1 ملغم / كغم من وزن الجسم) تحت الجلد قبل الجراحة للسيطرة على الألم. كرر التخدير كل 4-6 ساعات لمدة 3 أيام على الأقل بعد الجراحة. ضع في اعتبارك كتلة بوبيفاكايين على طول الشق لمزيد من السيطرة على الألم.

5. تقييم ABG

ملاحظة: إذا كان قياس ABG مطلوبا ، فمن الأفضل الحصول عليه عن طريق شفط الدم الشرياني من البطين الأيسر. للتأكد من أن ABG يعكس وظيفة الرئة اليسرى فقط ، يجب الحصول على هذا الدم الشرياني بعد حوالي 4 دقائق من تثبيت الهيلوم الأيمن^22,23 ، وخلال هذه الفترة تقوم الرئة اليسرى فقط بإجراء الأوكسجين والتهوية.

1. إذا تم إيقاظ الفأر من التخدير بعد مشبك النقيض ، فقم بإعادة تخدير الفأر وتنبيبه وفقا للخطوة 1.
2. قبل حوالي 15-20 دقيقة من نهاية وقت التروية المطلوب ، ضع الماوس مستلقا ، وقم بتأمين جميع الأطراف الأربعة بشريط.
   ملاحظة: يجب تخصيص متسع من الوقت لتنفيذ الخطوات التالية قبل نهاية إعادة التروية. يختلف التوقيت المحدد لفتح البطن والصدر اعتمادا على الجراح وخبرته.
3. قم بإجراء بضع البطن في خط الوسط من عظم العانة إلى الخنجري ، مع شق الجلد بالمقص متبوعا بجدار البطن على طول خط ألبا (انظر الشكل 5 أ - ب).
4. عند الخنجري ، قم بتمديد بضع البطن يسارا ويمينا إلى الخط الإبطي الأمامي ، باتباع منحنى الضلع السفلي (انظر الشكل 5C).
5. من البطن ، شق الحجاب الحاجز الأمامي في خط الوسط لدخول الصدر ، مع الحرص على عدم التعمق كثيرا لتجنب إصابة القلب (انظر الشكل 5D-E). بعد ذلك ، قم بتمديد شق الحجاب الحاجز الأمامي يسارا ويمينا إلى الخط الإبطي الأمامي ، على طول الضلع السفلي (انظر الخط المنقط الأبيض في الشكل 5 د).
6. قسم الأضلاع الثنائية على طول الخط الإبطي الأمامي ، وتمتد لأعلى نحو الإبط ، لإنشاء بضع صدر صدفي. بعد ذلك ، تعكس جدار الصدر الأمامي (القص والأضلاع الأمامية الثنائية) cephalad ، والذي يسمح بالتعرض الكامل للقلب والرئتين الثنائيتين (انظر الخطوط المنقطة البيضاء في الشكل 5F).
7. ضع مشبكا على جدار الصدر الأمامي المقلوب لتسهيل التراجع. اسحب الحجاب الحاجز إلى أسفل باستخدام مشبك بعوض منحني في خط الوسط لتحسين تصور الصدر (انظر الشكل 5F).
8. لتعبئة الرئة اليمنى بالكامل (التي تحتوي على 4 فصوص) ، أعد الفص الملحق الذي يمتد بعد خط الوسط إلى الصدر الأيسر مرة أخرى إلى الصدر الأيمن (انظر الشكل 5G-H). هناك رباط رفيع يربط هذا الفص بالصدر الأيسر - قسم هذا إما بصراحة باستخدام أدوات تطبيق ذات رؤوس قطنية أو بحدة بالمقص.
   ملاحظة: يعبر هذا الفص الملحق خط الوسط الخلفي إلى الوريد الأجوف السفلي (IVC) ، لذلك يجب توخي الحذر لعدم إصابة IVC أثناء هذه المناورة.
9. بمجرد إرجاع جميع الفصوص إلى الصدر الأيمن ، اعكس الرئة اليمنى بالكامل من الأمام وضع ربطة عنق حريرية أخرى 6-0 (مقطوعة إلى ~ 10 سم) خلف الهيلوم الأيمن. ثم استبدل الرئة اليمنى مرة أخرى في الصدر فوق ربطة العنق.
10. اربط عقدة انزلاقية أخرى حول الهيلوم الأيمن باستخدام نفس التقنية الموضحة في الخطوة 3.4 ، مع الحرص على تطويق جميع الفصوص الأربعة للرئة اليمنى. يجب توقيت خطوة المشبك النقيري الأيمن هذه لتكون حوالي 4 دقائق قبل نهاية إعادة التروية.
11. قم بتغطية إبرة 1/2 بوصة 31G على حقنة 1 سم مكعب من السل مع حوالي 200 ميكرولتر من الهيبارين 1000 وحدة / مل. للقيام بذلك ، قم بسحب حجم الهيبارين واسحب المكبس مرارا وتكرارا ذهابا وإيابا 3-4 مرات للسماح للهيبارين بتغطية الجزء الداخلي بالكامل من المحقنة. يتم ذلك لتقليل خطر تخثر الدم المستنشق أثناء النقل من المحطة الجراحية إلى جهاز ABG .
12. بعد 4 دقائق من لقط النقيرة اليمنى ، قم بشفط الدم الشرياني من البطين الأيسر إلى المحقنة المغلفة بالهيبارين (انظر الشكل 5I). احرص على تجنب ثقب الحاجز البطيني وشفط دم البطين الأيمن الوريدي عن غير قصد. هناك اختلاف واضح في اللون بين البطين الأيمن الداكن والبطين الأيسر الأكثر إشراقا (انظر الشكل 5I الداخلي). قم بتوجيه الإبرة نحو الرقبة اليسرى. قد تكون هناك حاجة إلى ثقوب متعددة للحصول على الدم الكافي لتشغيل ABG (~ 150 ميكرولتر).
    ملاحظة: خلال 4 دقائق من المشبك النقيري الأيمن ، قد يبدأ الفأر في إظهار التنفس الناهض الذي ينذر بالموت الوشيك. في حالة حدوث ذلك ، يجب استنشاق الدم الشرياني على وجه السرعة قبل السكتة القلبية. لا يمكن استنشاق الدم من قلب غير نابض.
13. قم بتشغيل الدم الشرياني على جهاز ABG للحصول على تشبع الأكسجين ، والضغط الجزئي للأكسجين ، والضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون ، من بين قياسات أخرى. القتل الرحيم للفأر بعد جمع ABG و / أو علاج الأجسام المضادة (انظر الخطوة 6).

6. حقن الأجسام المضادة في الوريد لقياس تسرب الخلايا

ملاحظة: يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد تسرب الخلايا عن طريق حقن الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروكروم عن طريق الوريد في IVC قبل التضحية متبوعا بتحليل التدفق الخلوي ، كما نشر^{سابقا 18}. باختصار ، يمكن تمييز العدلات داخل الأوعية الدموية عن العدلات الخلالية باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل Ly6G الخاصة بالعدلات. يتم حقن الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (المسمى FITC) المضاد ل Ly6G (استنساخ 1A8) عن طريق الوريد قبل 5 دقائق من التضحية ، والذي يصف العدلات المنتشرة داخل الأوعية. تركيز الجسم المضاد FITC-Ly6G المستخدم هو 100 نانوغرام مخفف في 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. بعد ذلك ، بعد تحضير تعليق خلية واحدة من الرئة اليسرى لقياس التدفق الخلوي ، يتم تمييز جميع العدلات بعلامة allophycocyanin (المسمى APC) المضاد ل Ly6G (استنساخ 1A8). وبالتالي ، فإن العدلات APC-Ly6G ⁺ FITC-Ly6G ⁺ داخل الأوعية الدموية بينما APC-Ly6G ⁺ FITC-Ly6G^- خارج الأوعية الدموية أو الخلالية. يمكن تكييف هذه التقنية مع الخلايا الوحيدة ذات الأجسام المضادة المضادة ل Ly6C ، والخلايا البائية ذات الأجسام المضادة ل CD19 ، على سبيل المثال.

1. قم بتحميل الجسم المضاد المطلوب في حقنة 3/10 سم مكعب بإبرة 5/16 بوصة 31G ، مع الحرص على تقليل فقاعات الهواء داخل المحقنة. استخدم هذا للحقن في الوريد في IVC في الخطوة 6.5.
2. إجراء بضع البطن وفقا للخطوات 5.3-5.4.
3. بعد فتح البطن ، قم بإجراء الدوران الحشوي الإنسي الأيمن بصراحة باستخدام قضيبين مدببين برأس قطني. في الفأر ، يتم ذلك عن طريق نزع كل الأمعاء على يسار البطن ، مما سيسمح برؤية واضحة لل IVC (انظر الشكل 6 أ).
4. قم بإزالة الدهون التي تغطي IVC بصراحة باستخدام أدوات التطبيق ذات الرؤوس القطنية.
5. حقن محلول الأجسام المضادة في IVC عن طريق بزل الوريد (انظر الشكل 6B). عند استخراج الإبرة ، قم بالضغط اللطيف على الفور باستخدام قطعة قطن على موقع بزل الوريد حتى يصبح مرقئا (عادة حوالي 2-3 دقائق).
6. أعد الأمعاء المنزوعة الأحشاء إلى البطن فوق قطعة القطن لمواصلة الضغط على IVC (انظر الشكل 6C).
7. قم بإجراء بضع الصدر الصدفي وفقا للخطوات 5.5-5.7 لحصاد الرئة اليسرى. اسمح للأجسام المضادة بالحصول على 5 دقائق على الأقل لتنتشر بشكل منهجي قبل التضحية والحصاد. القتل الرحيم للفأر بعد جمع ABG و / أو علاج الأجسام المضادة.

7. تلطيخ الأنسجة (H &E)

1. بعد تثبيت الفورمالين وتضمين البارافين في الرئة اليسرى وتقسيمها إلى سمك 5 ميكرومتر ، قم بإزالة الشريحة في الزيلين (غسلتان لمدة 10 دقائق).
2. يجفف في غسل الإيثانول المتسلسل: 2 × 5 دقائق يغسل بنسبة 100٪ ، 1 × 2 دقيقة غسيل بنسبة 95٪ ، و 1 × 2 دقيقة غسيل مع 70٪ إيثانول. ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات.
3. قم بتلطيخ الشريحة بالهيماتوكسيلين لمدة 2-4 دقائق ، ثم اغسلها بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق أو حتى تصبح صافية. يجب تحسين المدة الدقيقة لتلطيخ الهيماتوكسيلين للأنسجة وكثافة التلوين النووي المطلوبة.
4. يغسل في محلول محدد لمدة 30 ثانية لتمييز البقع ، ثم يغسل في الماء لمدة 2 دقيقة. يغسل في محلول تشكيل اللون الأزرق لمدة 30 ثانية ، ثم يغسل في الماء لمدة 2 دقيقة.
5. قم بتجفيف المزيد عن طريق غمس 95٪ إيثانول 15x. وصمة عار في يوزين لمدة 1 دقيقة.
6. قم بتجفيف مع غسل الإيثانول لمدة دقيقتين (2x) ، متبوعا بغسلتين من الزيلين لمدة دقيقتين (2x). ضع وسائط التثبيت وقسيمة الغطاء.

النتائج

بعد لقط الظهيرة اليسرى ، يكون الضغط الجزئي للأكسجة في الدم الشرياني (PaO₂) المنسوب إلى الرئة اليسرى ~ 100 مم زئبق ، وهو أقل بكثير مقارنة ب ~ 500 مم زئبق بعد بضع الصدر الوهمي (الشكل 7 أ ، ن = 6-7). وتجدر الإشارة إلى أنه تم إجراء عمليات استئصال الصدر الوهمية في الفئران B6 مع قياس ABG ال...

Discussion

وصفنا تقنية المشبك النقيري التي تنطوي على تطبيق عقدة منزلقة على الهيلوم الأيسر الذي يسد الشريان الرئوي والأوردة والشعب الهوائية للحث على نقص التروية الدافئ متبوعا بإعادة التروية. بعد لقط النقيض ، يمكن حصاد الرئة اليسرى لمجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية مثل علم الأنسجة ، وقياس التدفق ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection