حمض الريتينويك المغلف بمستحلب النانو الموجبة كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة ب OVA

Summary

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير حمض الريتينويك المغلف بمستحلب نانوي كاتيوني (RA) لاستخدامه كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة بالمستضد. من خلال إضافة التهاب المفاصل الروماتويدي المعتمد من إدارة الغذاء والدواء إلى المستحلب النانوي ، تم تعزيز sIgA الخاص بالمستضد في المهبل والأمعاء الدقيقة بعد الحقن العضلي للمستحلب النانوي.

Abstract

ظهرت الهياكل النانوية الكاتيونية كنظام توصيل مساعد ومستضد يعزز نضوج الخلايا المتغصنة ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية ، وامتصاص المستضد ، ثم يعزز الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد. في السنوات الأخيرة ، تلقى حمض الريتينويك (RA) اهتماما متزايدا بسبب تأثيره في تنشيط الاستجابة المناعية المخاطية. ومع ذلك ، من أجل استخدام RA كمساعد مخاطي ، من الضروري حل مشكلة حلها وتحميلها وتسليمها. هنا ، نصف نظام توصيل حمض الريتينويك المغلف بمستحلب النانو الموجبة (CNE-RA) المكون من الدهون الكاتيونية 1،2-ديوليويل-سن-جليسيرو-3-فوسفوكولين (DOTAP) ، وحمض الريتينويك ، والسكوالين كمرحلة الزيت ، وبوليسوربات 80 كخافض للتوتر السطحي ، وثلاثي السوربيتان 85 كخافض للتوتر السطحي. تم تمييز خصائصه الفيزيائية والكيميائية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي ومقياس الطيف الضوئي. أدى تحصين الفئران بمزيج من المستضد (ovalbumin ، OVA) و CNE-RA إلى رفع مستويات الغلوبولين المناعي الإفرازي المضاد ل OVA A (sIgA) بشكل كبير في سائل غسل المهبل وسائل غسل الأمعاء الدقيقة للفئران مقارنة ب OVA وحده. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتوصيف وتقييم التأثير المساعد ل CNE-RA.

Introduction

غالبا ما تستخدم المواد المساعدة لتعزيز فعالية اللقاح عن طريق تحفيز الجهاز المناعي على الاستجابة بقوة أكبر للقاح ، وبالتالي زيادة المناعة ضد ممرض معين¹. يشير المستحلب النانوي (NE) المساعد إلى نظام تشتت غروي مع استقرار ديناميكي حراري عن طريق استحلاب نسبة معينة من طور الزيت والطور المائي لإنتاج مستحلب على شكل ماء في الزيت (W / O) أو زيت في الماء (O / W) ². يمكن لمستحلب النانو O / W أن ينتج السيتوكينات والكيموكينات في موقع الحقن ، ويحفز التجميع السريع وتكاثر الخلايا المناعية المهمة مثل الخلايا الوحيدة ، والعدلات ، والحمضات ، ويعزز الاستجابة المناعية ، ويحسن مناعة المستضدات³. حاليا ، تم ترخيص ثلاثة موا....

Protocol

تم إجراء التجارب على وفقا لدليل استخدام ورعاية المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية وأخلاقيات المختبر في الجامعة الطبية العسكرية الثالثة.

1. تحضير المستحلبات النانوية (NEs)

1. لتحضير الطور المائي، قم بإذابة 0.15 جم من بوليسوربات 80 في 28.2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع التحريك عند 40 درجة مئوية.
2. لإعداد طور الزيت ، استخدم تركيبة طور الزيت للمستحلب النانوي الموضح في الجدول 1. قم بإذابة ثلاثي السورنيتان 85 و DOTAP و RA في السكوالين مع التحريك عند 40 درجة مئوية.
3. لإعداد مستحلب O / W الأولي ، قم بتحريك طور الزيت مغناطيسيا عند 1400 دورة في الدقيقة مع إضافة الماء ببطء ....

النتائج

في المجموع ، تم تحضير أربع تركيبات مستحلب نانوي وتميزت بحجم جسيماتها (الشكل 1) ، وإمكانات زيتا وكفاءة تغليفها كما هو موضح في الجدول 2. تركز حجم الجسيمات حول 160-190 نانومتر وإضافة DOTAP عكست إمكانات زيتا للمستحلب النانوي. تم الكشف عن مصل IgG الخاص ب OVA ومستوى الأجسام المضاد?.......

Discussion

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير حمض الريتينويك المغلف بمستحلب نانوي كاتيوني لاستخدامه كمساعد لتعزيز الاستجابات الجهازية والمخاطية الخاصة بالمستضد. بالمقارنة مع المواد المساعدة التقليدية NE ، فإنه يتمتع بميزتين التاليتين. أولا ، بشكل عام ، يحتوي سطح O / W NEs على شحنة سالبة عالية ، مما يجعل م?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1640 medium	GIBCO, USA	C11875500BT
450 nm Stop Solution for TMB Substrate	Abcam	ab171529-1000 mL
Automated Cell Counter	Countstar, China	IC1000
BSA	Sigma-Aldrich, USA	B2064-100G
Centrifuge 5810 R	Eppendorf, Germany	5811000398
Danamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer Nano S90
DOTAP	CordenPharma, Switzerland	O02002
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP)	mabtech	ab205719
Fetal Bovine Serum	GIBCO, USA	10099141C
Full-function Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	VL0000D2
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP)	Abcam	ab97240-1mg
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP)	Abcam	ab97235-1mg
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)	Abcam	Ab205720-500ug
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP)	Abcam	ab97245-1mg
High pressure homogenizer	ATS
MONTANE 85 PPI	SEPPIC, France	L12910
MONTANOX 80 PPI	SEPPIC, France	36372K
OVA257–264	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
OVA323-339	Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd.	NA
Phosphate buffer saline	ZSGB-bio	ZLI-9061
Red Blood Cell Lysis Buffer	Solarbio, China	R1010
retinoic acid	TCI, Japan	TCI-R0064-5G
Squalene	Sigma, USA	S3626
T10 basic Ultra-Turrax	IKA, Germany
TMB ELISA Substrate	Abcam	ab171523-1000ml
trypsin inhibitor	Diamond	A003570-0100
Tween-20	Macklin, China	9005-64-5
Ultraviolet spectrophotometer	Hitachi	U-3900