A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكول تطور تجريبي للتكيف في المحبة للحرارة باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة كحاضنات. يتم توضيح هذه التقنية من خلال توصيف التكيف مع درجة الحرارة في Sulfolobus acidocaldarius ، وهو أثري بدرجة حرارة نمو مثالية تبلغ 75 درجة مئوية.

Abstract

برز الأركيون Sulfolobus acidocaldarius كنظام نموذجي واعد للحرارة. يعد التحقيق في كيفية تكيف المحبة للحرارة مع درجات الحرارة المتغيرة مطلبا رئيسيا ، ليس فقط لفهم العمليات التطورية الأساسية ولكن أيضا لتطوير S. acidocaldarius كهيكل للهندسة الحيوية. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام إجراء التطور التجريبي مع المحبة للحرارة في تكلفة صيانة المعدات واستخدام الطاقة للحاضنات التقليدية للنمو في درجات الحرارة العالية. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي شامل لإجراء التطور التجريبي في S. acidocaldarius ، باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة. يتضمن البروتوكول تقنية استزراع دفعي بأحجام صغيرة نسبيا (1.5 مل) ، مما يتيح تتبع التكيف في سلالات مستقلة متعددة. هذه الطريقة قابلة للتطوير بسهولة من خلال استخدام خلاطات حرارية إضافية. مثل هذا النهج يزيد من إمكانية الوصول إلى S. acidocaldarius كنظام نموذجي عن طريق تقليل كل من الاستثمار الأولي والتكاليف الجارية المرتبطة بالتحقيقات التجريبية. علاوة على ذلك ، يمكن نقل هذه التقنية إلى أنظمة ميكروبية أخرى لاستكشاف التكيف مع الظروف البيئية المتنوعة.

Introduction

قد تكون الحياة المبكرة على الأرض قد نشأت في بيئات قاسية ، مثل الفتحات الحرارية المائية ، والتي تتميز بدرجات حرارة وحموضة عالية للغاية1. تستمر الميكروبات في العيش في البيئات القاسية ، بما في ذلك الينابيع الساخنة والصولفاتارا البركانية. إن توصيف الديناميات التطورية التي تحدث في ظل هذه الظروف القاسية قد يلقي الضوء على العمليات الفسيولوجية المتخصصة التي تمكن من البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف. وقد يكون لذلك آثار واسعة النطاق، من فهمنا لأصول التنوع البيولوجي إلى تطوير إنزيمات جديدة ذات درجة حرارة عالية مع تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

لا يزال فهم الديناميات التطورية الميكروبية في ال....

Protocol

1. تحضير وسط نمو S. acidocaldarius (BBM +)

ملاحظة: لزراعة S. acidocaldarius ، يستخدم هذا البروتوكول وسط بروك القاعدي (BBM +) 23. يتم إعداد ذلك من خلال الجمع أولا بين حلول المخزون غير العضوية الموضحة أدناه لإنشاء BBM− ، والتي يمكن إعدادها مسبقا. ثم يتم تحضير BBM+ حسب الحاجة عن طريق إضافة حلول المخزون العضوي إلى BBM. يتم عرض وصفات حل الأسهم أيضا في الجدول 1. يجب تحضير جميع حلول الوسائط والمخزون في H2O المقطر المزدوج (ddH2O).

  1. إعداد حلول المخزون غير....

النتائج

قياسات منحنى النمو
منحنيات النمو ل S. acidocaldarius DSM639 موضحة في الشكل 3A. وجد أن النمو متشابه عند مقارنة الحضانة باستخدام الخلاطات الحرارية مع تلك الموجودة في الحاضنات التقليدية. تم تقدير متوسط معلمات معدل النمو عن طريق تركيب منحنى لوجستي لكل من.......

Discussion

طور هذا العمل بروتوكول تطور تجريبي لمحبي الحرارة ، مصمم هنا ل Archaion S. acidocaldarius ، ولكنه قابل للتكيف مع الميكروبات الأخرى ذات متطلبات النمو ذات درجات الحرارة العالية. يعتمد هذا البروتوكول على التقنيات المصممة في البداية للبكتيريا متوسطة الحجم ولكن تم تعديلها خصيصا للت.......

Disclosures

لا يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون البروفيسور SV Albers (جامعة فرايبورغ) ، والبروفيسور إيفلين بيترز (Vrije Universiteit Brussel) ، والدكتور راني بايس (Vrije Universiteit Brussel) على المشورة وسلالة S. acidocaldarius DSM639. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الملكية (الممنوحة ل DRG: RGS \ R1 \ 231308) ، ومنحة أبحاث UKRI-NERC "استكشاف الحدود" (الممنوحة ل DRG و CGK: NE / X012662 / 1) ، ومنحة الدكتوراه من جامعة الكويت (الممنوحة ل ZA).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe-driven membrane filtersStarLabE4780-1226For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loopsGreiner731161, 731165, or 731101For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tipsStarLabS1111-6811Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubesStarLabS1620-2700For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tipsStarLabS1111-0816Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottomCorning430828 or 430829Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. 
50 mL syringeBD plastipak300865For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)Nunc260860For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipettePipet-LiteLA8-300XLSOptional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Millipore168355For Brock stock solution I.
AutoclavePriorclaveB60-SMART or SV100-BASEOther autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membraneSigma-AldrichZ763624-100EACut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)GreinerM9062Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)Supelco1025560100For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)Sigma-Aldrich307483For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)Thermo Scientific Chemicals11462858Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishesBrandBR455742Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
IncubatorNew BrunswickInnnova 42ROther incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)Supelco103943For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)Sigma-Aldrich230391For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100GFor Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy MonitoringTapoTapo P110To monitor energy consumtion 
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate Sigma-AldrichC0626-500GN-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)nonenoneFor piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)Sigma-AldrichM1651-100GFor Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)Sigma-AldrichS9640For Trace element stock solution.
SpectrophotometerBMGSPECTROstar OMEGAFor measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)Thermo Scientific Chemicals11337588Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
ThermomixerDLabHM100-ProOther thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)Sigma-Aldrich204862For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)Sigma-Aldrich221376For Trace element stock solution.

References

  1. Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
  2. Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  3. Lenski, ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Sulfolobus acidocaldarius Thermophile

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved