A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
هنا ، نقدم بروتوكول تطور تجريبي للتكيف في المحبة للحرارة باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة كحاضنات. يتم توضيح هذه التقنية من خلال توصيف التكيف مع درجة الحرارة في Sulfolobus acidocaldarius ، وهو أثري بدرجة حرارة نمو مثالية تبلغ 75 درجة مئوية.
برز الأركيون Sulfolobus acidocaldarius كنظام نموذجي واعد للحرارة. يعد التحقيق في كيفية تكيف المحبة للحرارة مع درجات الحرارة المتغيرة مطلبا رئيسيا ، ليس فقط لفهم العمليات التطورية الأساسية ولكن أيضا لتطوير S. acidocaldarius كهيكل للهندسة الحيوية. تتمثل إحدى العقبات الرئيسية أمام إجراء التطور التجريبي مع المحبة للحرارة في تكلفة صيانة المعدات واستخدام الطاقة للحاضنات التقليدية للنمو في درجات الحرارة العالية. لمواجهة هذا التحدي ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي شامل لإجراء التطور التجريبي في S. acidocaldarius ، باستخدام خلاطات حرارية منخفضة التكلفة وموفرة للطاقة. يتضمن البروتوكول تقنية استزراع دفعي بأحجام صغيرة نسبيا (1.5 مل) ، مما يتيح تتبع التكيف في سلالات مستقلة متعددة. هذه الطريقة قابلة للتطوير بسهولة من خلال استخدام خلاطات حرارية إضافية. مثل هذا النهج يزيد من إمكانية الوصول إلى S. acidocaldarius كنظام نموذجي عن طريق تقليل كل من الاستثمار الأولي والتكاليف الجارية المرتبطة بالتحقيقات التجريبية. علاوة على ذلك ، يمكن نقل هذه التقنية إلى أنظمة ميكروبية أخرى لاستكشاف التكيف مع الظروف البيئية المتنوعة.
قد تكون الحياة المبكرة على الأرض قد نشأت في بيئات قاسية ، مثل الفتحات الحرارية المائية ، والتي تتميز بدرجات حرارة وحموضة عالية للغاية1. تستمر الميكروبات في العيش في البيئات القاسية ، بما في ذلك الينابيع الساخنة والصولفاتارا البركانية. إن توصيف الديناميات التطورية التي تحدث في ظل هذه الظروف القاسية قد يلقي الضوء على العمليات الفسيولوجية المتخصصة التي تمكن من البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف. وقد يكون لذلك آثار واسعة النطاق، من فهمنا لأصول التنوع البيولوجي إلى تطوير إنزيمات جديدة ذات درجة حرارة عالية مع تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.
لا يزال فهم الديناميات التطورية الميكروبية في ال....
1. تحضير وسط نمو S. acidocaldarius (BBM +)
ملاحظة: لزراعة S. acidocaldarius ، يستخدم هذا البروتوكول وسط بروك القاعدي (BBM +) 23. يتم إعداد ذلك من خلال الجمع أولا بين حلول المخزون غير العضوية الموضحة أدناه لإنشاء BBM− ، والتي يمكن إعدادها مسبقا. ثم يتم تحضير BBM+ حسب الحاجة عن طريق إضافة حلول المخزون العضوي إلى BBM−. يتم عرض وصفات حل الأسهم أيضا في الجدول 1. يجب تحضير جميع حلول الوسائط والمخزون في H2O المقطر المزدوج (ddH2O).
قياسات منحنى النمو
منحنيات النمو ل S. acidocaldarius DSM639 موضحة في الشكل 3A. وجد أن النمو متشابه عند مقارنة الحضانة باستخدام الخلاطات الحرارية مع تلك الموجودة في الحاضنات التقليدية. تم تقدير متوسط معلمات معدل النمو عن طريق تركيب منحنى لوجستي لكل من.......
طور هذا العمل بروتوكول تطور تجريبي لمحبي الحرارة ، مصمم هنا ل Archaion S. acidocaldarius ، ولكنه قابل للتكيف مع الميكروبات الأخرى ذات متطلبات النمو ذات درجات الحرارة العالية. يعتمد هذا البروتوكول على التقنيات المصممة في البداية للبكتيريا متوسطة الحجم ولكن تم تعديلها خصيصا للت.......
لا يعلن المؤلفون عن أي تضارب في المصالح.
يشكر المؤلفون البروفيسور SV Albers (جامعة فرايبورغ) ، والبروفيسور إيفلين بيترز (Vrije Universiteit Brussel) ، والدكتور راني بايس (Vrije Universiteit Brussel) على المشورة وسلالة S. acidocaldarius DSM639. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث الجمعية الملكية (الممنوحة ل DRG: RGS \ R1 \ 231308) ، ومنحة أبحاث UKRI-NERC "استكشاف الحدود" (الممنوحة ل DRG و CGK: NE / X012662 / 1) ، ومنحة الدكتوراه من جامعة الكويت (الممنوحة ل ZA).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
Double-distilled water (ddH2O) | |||
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved