تقدير الحساسية التركيبية للمناطق المضطربة جوهريا استجابة للإجهاد المفرط الأسموزي في الخلايا الحية باستخدام FRET

Summary

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية مرنة تعدل شكلها استجابة للتغيرات البيئية. يمكن ل Ensemble fluorescence resonation Transfer Energy (FRET) تقدير أبعاد البروتين في ظل ظروف مختلفة. نقدم نهج FRET لتقييم الحساسية الهيكلية IDR في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية تحت ضغط فرط التناضح.

Abstract

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية تشارك في العمليات الخلوية الحاسمة. أثناء ظروف الإجهاد ، تتغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبيئة الخلوية ، مما يؤثر بشكل مباشر على المجموعة التوافقية من IDRs. IDRs حساسة بطبيعتها للاضطرابات البيئية. تعد دراسة كيفية تنظيم الخصائص الفيزيائية والكيميائية للخلية للمجموعة التوافقية من IDRs أمرا ضروريا لفهم التحكم البيئي في وظيفتها. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية استجابة لظروف الإجهاد المفرط الأسموزي. نقدم استخدام نقل طاقة الرنين الفلوري الجماعي (FRET) لتقدير كيفية تغير الأبعاد العالمية ل IDRs أثناء الزيادة التدريجية للإجهاد المفرط الأسموزي المفروض على الخلايا التي تحتوي على أي تناضح. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نصا لمعالجة قياسات التألق ومقارنة الحساسية الهيكلية لمختلف IDRs. باتباع هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على رؤى قيمة حول التغيرات التوافقية التي تخضع لها IDRs في الوسط المعقد داخل الخلايا عند البيئات المتغيرة.

Introduction

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مكونات حاسمة في العمليات الخلوية¹. بالاقتران مع المجالات المهيكلة، تعد IDRs ضرورية لوظائف البروتين. تركيبة الأحماض الأمينية ل IDRs متحيزة ، ممثلة بشكل أساسي بالمخلفات المشحونة والمحبة للماء والصغيرة. بسبب هذه الخاصية ، تعتبر IDRs نطاقات منخفضة التعقيد ^2,3. وقد حظيت العديد من الروابطات الإندونيسية بالاهتمام، ويرجع ذلك أساسا إلى أن هذه المناطق تلعب دورا حاسما في الحالات المرضية، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية. تتميز هذه الأمراض بالتجميع الذاتي والترسب اللاحق خارج الخلية أو داخل الخلايا من IDRs في الخلايا العصبية⁴. ومن الأمثلة على ه....

Protocol

1. بناء البلازميد

1. قم بتضخيم إطار القراءة المفتوح (ORF) الذي يرمز ل IDR المطلوب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لا تقم بتضمين كودون التوقف لأن ORF سيكون محاطا بالجينات التي تشفر البروتينات الفلورية. للتضخيم ، صمم البادئات مع مواقع تقييد SacI (5') و BglII (3').
   ملاحظة: بالنسبة لقسم النتائج التمثيلية، استخدمنا AtLEA4-5 باعتباره IDR المحدد. قمنا بتضخيم ORF ل AtLEA4-5 من بلازميد pTrc99A-AtLEA4-5¹².
2. هضم منتج ORF PCR عن طريق تقييد متتالي مع إنزيمات SacI و BglII¹³.
3. احصل على البلازميد التجاري pDRFLIP38-AtLEA4-5 (# 178189) من Addgene (h....

النتائج

بعد تحويل خلايا الخميرة باستخدام بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5 ، لوحظ مضان المحولات الإيجابية باستخدام محول الضوء الأزرق ومرشح (الشكل 1). يستغرق تحضير الحلول المختلفة للحث على الإجهاد الأسموزي المفرط وقتا طويلا ، لذلك نقترح اتباع نموذج 96 بئرا في الشكل 2. مباشرة بعد معا.......

Discussion

تقدم الطريقة المعروضة هنا طريقة للحصول على رؤى حول كيفية استشعار الأبعاد العالمية لمجموعة IDRs للاضطرابات البيئية والاستجابة لها. تعتمد هذه الطريقة على بنية مشفرة وراثيا ولا تتطلب مكونات إضافية تتجاوز التعبير المستقر للبلازميد في خلايا الخميرة ، مما يجعلها قابلة للتكيف مع التطبيقات المح?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500