الحقن داخل الفخذ للخلايا الجذعية والمكونة للدم البشرية والخلايا السلفية في الفئران المصابة بنقص المناعة

Summary

تسمح الحقن داخل الفخذ بنقش عدد صغير من الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم (HSPCs) ، عن طريق وضع الخلايا مباشرة في تجويف نخاع العظم. نصف هنا بروتوكولا تجريبيا للحقن داخل الفخذ ل HSPCs البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

Abstract

يتم تعريف الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من خلال قدرتها مدى الحياة على إنتاج جميع أنواع خلايا الدم. يتم اختبار ذلك عمليا عن طريق زرع مجموعات الخلايا التي تحتوي على الخلايا المنسقة في الفئران المتزاصلة أو التي تعاني من نقص المناعة. ثم يتم قياس حجم الكسب غير المشروع وتكوينه متعدد السلالات بمرور الوقت ، عادة عن طريق قياس التدفق الخلوي. بشكل كلاسيكي ، يتم حقن مجموعة تحتوي على HSCs في الدورة الدموية للحيوان ، وبعد ذلك تكون HSCs موطنا لنخاع العظام ، حيث تستقر وتبدأ في إنتاج الدم. بدلا من ذلك ، يمكن وضع الخلايا الجذعية الجذعية و / أو الخلايا السلفية (HSPCs) مباشرة في تجويف نخاع العظم.

تصف هذه الورقة بروتوكولا للحقن داخل الفخذ من HSPCs البشرية في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. باختصار ، يتم تخدير الفئران المكيفة مسبقا ، ويتم حفر ثقب صغير من خلال الركبة في عظم الفخذ باستخدام إبرة. باستخدام إبرة أنسولين أصغر ، يتم حقن الخلايا مباشرة في نفس القناة التي تم إنشاؤها بواسطة الإبرة الأولى. يمكن تطبيق طريقة الزرع هذه في تصميمات تجريبية متنوعة ، باستخدام خلايا الفأر أو الإنسان كخلايا مانحة. لقد تم استخدامه على نطاق واسع في زراعة الأعضاء ، لأنه في هذا السياق ، يعتقد أنه يوفر تحققا محسنا على الحقن في الوريد ، وبالتالي تحسين القوة الإحصائية وتقليل عدد الفئران التي سيتم استخدامها.

Introduction

يحتوي الدم على واحد من أعلى معدلات التجدد في جسم الإنسان ، حيث ينتج 1 × 10¹² خلية يوميا في نخاع العظام البشري^{البالغ 1}. تضمن الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) إنتاج الدم على مدى العمر الافتراضي من خلال عملية تكون الدم ويتم تحديدها من خلال قدرتها على إنتاج جميع أنواع خلايا الدم (تعدد الإمكانات) مع الحفاظ على نفسها (التجديد الذاتي). تاريخيا ، اعتمد المعيار الذهبي لاختبار وظيفة HSC دائما على الزرع ، واختبار قدرة المتبرعين على إعادة تكوين جميع سلالات الدم للفأر على المدى الطويل (يعرف عادة بأنه 20 أسبوعا على الأقل)². أثبتت مجموعة كبيرة من الأعمال الوظيفية التي امتدت لعدة عقود أن ح....

Protocol

تلتزم جميع الأبحاث على المعروضة هنا بلوائح تعديل قانون (الإجراءات العلمية) لعام 1986 لعام 2012 وتم إجراؤها بعد المراجعة الأخلاقية والموافقة من قبل هيئة رعاية والمراجعة الأخلاقية بجامعة كامبريدج (AWERB). إيماءة أنثى. تم استخدام الفئران Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl / SzJ (NSG) ، التي تتراوح أعمارها بين 12 و 16 أسبوعا (~ 21-30 جم) ، تم تربيتها في المنزل والحفاظ عليها في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض ، للحقن داخل الفخذ. تم جمع عينات CB غير المحددة من المتبرعين الأصحاء بعد موافقة مستنيرة من قبل بنك كامبريدج الحيوي للدم والخلايا الجذعية (CBSB) وفقا للإجراءات المنظمة المعتمدة من قبل لجنة أخلاقيات البحث المحلية في كام....

النتائج

يمكن تقييم نقش الخلايا المحقونة داخل الفخذ في أي وقت من 24 ساعة فصاعدا اعتمادا على التصميم التجريبي. في نقطة النهاية ، يمكن جمع IF ، BM ، PB ، والطحال. يمكن معالجتها ، وتقييم مستوى النقش عن طريق قياس التدفق الخلوي. لاستدعاء النقش البشري بقوة حتى عند المستويات المنخفضة ، قمنا ب?.......

Discussion

تعتبر الحقن داخل الفخذ أداة مفيدة في زراعة الأعضاء عندما يتوفر عدد صغير فقط من HSPCs ، مما يوفر تحسنا مقارنة بالحقن في الوريد. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية تتطلب البراعة والتدريب. عند التمرين ، نوصي باستخدام جثث جديدة من نطاق الوزن الصحيح (انظر أدناه) وحقن صبغة ملونة (مثل التريب.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169