JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق (AQRNA-seq) هو تقنية تم تطويرها لتحديد المناظر الطبيعية لجميع الحمض النووي الريبي الصغير في الخلائط البيولوجية. هنا ، يتم عرض كل من خطوات إعداد المكتبة ومعالجة البيانات الخاصة ب AQRNA-seq ، وتحديد التغيرات في تجمع الحمض النووي الريبي الناقل (tRNA) في المتفطرة البوفية BCG أثناء السكون الناجم عن الجوع.

Abstract

يوفر AQRNA-seq علاقة خطية مباشرة بين تسلسل عدد قراءات وأرقام نسخ الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينة بيولوجية ، مما يتيح القياس الكمي الدقيق لمجموعة الحمض النووي الريبي الصغير. يتضمن إجراء إعداد مكتبة AQRNA-seq الموصوف هنا استخدام روابط تسلسل مصممة خصيصا وخطوة لتقليل تعديلات الحمض النووي الريبي المثيلي التي تمنع عملية النسخ العكسي ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاجية cDNAs كاملة الطول. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم تنفيذ مفصل لخط أنابيب المعلوماتية الحيوية المصاحب. تم إجراء هذا العرض التوضيحي ل AQRNA-seq من خلال تحليل كمي ل 45 tRNAs في المتفطرة البوفية BCG التي تم حصادها في 5 أيام مختارة عبر دورة زمنية مدتها 20 يوما من الحرمان من المغذيات و 6 أيام من الإنعاش. كما سيتم مناقشة الجهود الجارية لتحسين كفاءة ودقة AQRNA-seq هنا. يتضمن ذلك استكشاف طرق لتجنب تنقية الجل للتخفيف من مشكلات dimer التمهيدي بعد تضخيم PCR وزيادة نسبة القراءات كاملة الطول لتمكين تعيين قراءة أكثر دقة. ستركز التحسينات المستقبلية على AQRNA-seq على تسهيل الأتمتة والتنفيذ عالي الإنتاجية لهذه التكنولوجيا لتحديد جميع أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة في عينات الخلايا والأنسجة من الكائنات الحية المتنوعة.

Introduction

تسلسل الجيل التالي (NGS) ، المعروف أيضا باسم التسلسل المتوازي على نطاق واسع ، هو تقنية تسلسل الحمض النووي التي تتضمن تجزئة الحمض النووي ، وربط قليل النيوكليوتيدات المحول ، والتضخيم القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتسلسل الحمض النووي ، وإعادة تجميع تسلسل الشظايا في الجينوم. يعد تكييف NGS مع تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) نهجا قويا لتحديد وقياس نسخ الحمض النووي الريبي ومتغيراتها1. أدت التطورات المبتكرة في سير عمل إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي وخطوط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية ، إلى جانب التقدم في الأجهزة المختبرية ، إلى توسيع ذخيرة تطبيقات RNA-seq ، والتقدم إلى ما بعد تسلسل الإكسوم إلى omics وظيفية متقدمة مثل تنميط الحمض النووي الريبي غير المشفر2 ، تحليل الخلية الواحدة3 ، علم النسخ المكاني 4,5 ، تحليل الربط البديل6، من بين أمور أخرى. تكشف طرق RNA-seq المتقدمة هذه عن وظائف الحمض النووي الريبي المعقدة من خلال التحليل الكمي للنسخ في الخلايا والأنسجة الطبيعية والمريضة.

على الرغم من هذه التطورات في RNA-seq ، فإن العديد من الميزات التقنية الرئيسية تحد من القوة الكمية للطريقة. في حين أن معظم طرق RNA-seq تسمح بالقياس الكمي الدقيق والدقيق للتغيرات في مستويات الحمض النووي الريبي بين المتغيرات التجريبية (أي العينات البيولوجية و / أو الحالات الفسيولوجية) ، فإنها لا يمكن أن توفر مقارنات كمية لمستويات جزيئات الحمض النووي الريبي داخل العينة. على سبيل المثال ، لا يمكن لمعظم طرق RNA-seq تحديد العدد النسبي لنسخ جزيئات متقبلات tRNA الفردية بدقة في مجموعة خلوية من tRNAs المعبر عنها. كما هو موضح في المنشور المصاحب7 ، ينشأ هذا القيد على RNA-seq من العديد من ميزات بنية الحمض النووي الريبي والكيمياء الحيوية لإعداد المكتبة. على سبيل المثال ، يتأثر نشاط إنزيمات الربط المستخدمة لربط روابط تسلسل النهاية 3 و 5 بجزيئات الحمض النووي الريبي بشدة بهوية النيوكليوتيدات الطرفية للحمض النووي الريبي وروابط التسلسل. وهذا يؤدي إلى اختلافات كبيرة في كفاءات روابط الروابط والزيادات الأثرية العميقة في التسلسل يقرأ8،9،10.

تنشأ مجموعة ثانية من القيود من الخصائص الهيكلية المتأصلة لجزيئات الحمض النووي الريبي. على وجه التحديد ، يمكن أن يتسبب تكوين بنية الحمض النووي الريبي الثانوية والتغيرات الديناميكية في العشرات من تعديلات الحمض النووي الريبي بعد النسخ في حدوث خلل في البلمرة أو طفرة أثناء النسخ العكسي. تؤدي هذه الأخطاء إلى تخليق cDNA غير مكتمل أو مقطوع أو تسلسل RNA متغير. في حين يمكن استغلال هاتين الظاهرتين لتعيين الهياكل الثانوية أو بعض التعديلات ، إلا أنهما تتدهوران الدقة الكمية ل RNA-seq إذا فشلت خطوات إعداد المكتبة اللاحقة في التقاط cDNAs المقطوعة أو إذا أدت معالجة البيانات إلى التخلص من التسلسلات المتحولة التي لا تتطابق مع مجموعة البيانات المرجعية11،12. علاوة على ذلك ، فإن التنوع الكيميائي والطول والهيكل الهائل لنسخ الحمض النووي الريبي ، بالإضافة إلى نقص الأدوات اللازمة لتفتيت الحمض النووي الريبي الطويل بشكل موحد ، يقلل من قابلية تطبيق معظم طرق RNA-seq على جميع أنواع الحمض النووي الريبي13.

تم تطوير طريقة AQRNA-seq (تسلسل الحمض النووي الريبي الكمي المطلق) لإزالة العديد من هذه القيود التقنية والبيولوجية التي تحد من الدقة الكمية7. من خلال تقليل التحيزات المعتمدة على التسلسل في الالتقاط والربط والتضخيم أثناء إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي ، يحقق AQRNA-seq خطية فائقة مقارنة بالطرق الأخرى ، حيث يحدد بدقة 75٪ من مكتبة مرجعية من 963 miRNAs بدقة 2 ضعف. لوحظ هذا الارتباط الخطي لعدد قراءات التسلسل ووفرة الحمض النووي الريبي أيضا في تحليل مجموعة متغيرة الطول من معايير قليل النوكليوتيد الحمض النووي الريبي وفي إشارة إلى الطرق المتعامدة مثل النشاف الشمالي. إن تحديد الخطية بين عدد قراءات التسلسل ووفرة الحمض النووي الريبي يمكن AQRNA-seq من تحقيق تقدير كمي دقيق ومطلق لجميع أنواع الحمض النووي الريبي داخل العينة.

فيما يلي وصف لبروتوكول سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq وخط أنابيب تحليلات البيانات المصاحب لها. تم تطبيق الطريقة لتوضيح ديناميات وفرة الحمض النووي الريبي أثناء السكون الناجم عن الجوع والإنعاش اللاحق في نموذج المتفطرة البوفية عصيات دي كالميت وغيران (BCG) لمرض السل. تم تقديم النتائج للتصور الاستكشافي لبيانات التسلسل ، جنبا إلى جنب مع تحليلات التجميع والتعبير التفاضلي اللاحقة التي كشفت النقاب عن أنماط يمكن تمييزها في وفرة tRNA المرتبطة بالأنماط الظاهرية المختلفة.

Protocol

ملاحظة: يقدم الشكل 1 توضيحا بيانيا للإجراءات التي ينطوي عليها إعداد مكتبة AQRNA-seq. يمكن العثور على معلومات مفصلة بشأن الكواشف والمواد الكيميائية والأعمدة / المجموعات المستخدمة في الإجراء في جدول المواد. يوصى بإجراء تقييم شامل لنقاء وسلامة وكمية عينات الحمض النووي الريبي المدخلة باستخدام (i) 3٪ من هلام الأغاروز الكهربائي ، (ii) أدوات الرحلان الكهربائي الآلي لمراقبة جودة العينة للجزيئات الحيوية (انظر جدول المواد) ، و (iii) قياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية و / أو القياس الكمي الفلورومتري. من الضروري الاحتفاظ بجميع التفاعلات والخلطات الرئيسية على الجليد ، ما لم ينص على خلاف ذلك. نقل الكواشف (مثل الإنزيمات) في صناديق باردة من وإلى التخزين -20 درجة مئوية للحفاظ على مدة صلاحيتها وتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة لوسيطة المكتبة.

1. نزع الفسفرة من الحمض النووي الريبي

ملاحظة: إزالة 5'-فوسفات (P؛ مانح) يمنع الربط الذاتي إلى 3'-هيدروكسيل (OH ؛ متقبل) من الحمض النووي الريبي. لن يتم ربط الروابط ذاتيا حيث يتم تعديل نهايتها 3 بوصات لدمج إما ثنائي ديوكسيسيتيدين (رابط 1) أو فاصل (رابط 2). لا يمكن ربط الروابط إلا من خلال الانضمام إلى 5'-P إلى 3'-OH من الحمض النووي الريبي أو cDNAs.

  1. تحضير تفاعل إزالة الفسفرة في أنبوب PCR معقم (على سبيل المثال ، أنبوب 200 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر) عن طريق إضافة ما يصل إلى 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي ، 0.5 ميكرولتر من مثبط إنزيم RNase 40 وحدة / ميكرولتر ، 1 ميكرولتر من المعيار الداخلي 0.5 ميكرومتر (الجدول 1) ، 0.5 ميكرولتر من 10x T4 RNA ligase تفاعل المخزن المؤقت ، 1 ميكرولتر من 1 وحدة / ميكرولتر الروبيان الفوسفاتيز القلوي ، ومياه كافية خالية من RNase لرفع الحجم الكلي إلى 5 ميكرولتر.
    ملاحظة: بالنسبة للعينات النموذجية ، يعتبر 75 نانوغرام من الحمض النووي الريبي (أو ما يقرب من 2 pmol ل 80 nt RNA) كافيا للقياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير باستخدام هذا البروتوكول.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة فسفرة الحمض النووي الريبي ثم عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل الإنزيم وتشويه الحمض النووي الريبي. احتفظ بالعينات عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل لمنع إعادة التجديد.

2. ربط الرابط 1 بنهاية 3 'من الحمض النووي الريبي

  1. تحضير تفاعل ربط Linker 1 في أنبوب PCR معقم عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المفسفر (منتجات من الخطوة 1) ، 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase 40 وحدة / ميكرولتر ، 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر رابط 1 (الجدول 1) ، 3 ميكرولتر من 10 مللي متر ATP ، 2.5 ميكرولتر من 10x T4 RNA ligase تفاعل المخزن المؤقت ، 15 ميكرولتر من PEG8000 (محلول 50٪) ، 2 ميكرولتر من 30 U / μL T4 RNA ligase 1 ، و 1 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
    ملاحظة: يمكن تحويل الكواشف إلى مزيج رئيسي لتسهيل معالجة العينات. لا تقم بتضمين PEG8000 و T4 RNA ligase 1 في المزيج الرئيسي.
  2. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ثم عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لربط الرابط 1 بالحمض النووي الريبي.
  3. تنقية العمود الحمض النووي الريبي المرتبط ب Linker-1. استخدم مجموعة لاستعادة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتنظيفه (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: ينطبق بروتوكول تنقية العمود هذا على جميع عمليات تنقية الأعمدة اللاحقة باستخدام نفس المجموعة. لا يمكن استخدام المجموعات التي تستخدم تقنية الترشيح الهلامي لإزالة نهايات الصبغة من تفاعلات التسلسل (انظر جدول المواد) هنا ، لأن PEG8000 لا يتوافق مع مرشحات الهلام لهذه المجموعات. يوصى بحفظ قسمة (1.2 ميكرولتر) من كل عينة بعد التنقية. عند الضرورة ، يمكن استخدام هذه القسوم للتحقق من كفاءة الربط عن طريق تشغيل محلل الحمض النووي التجاري. احتفظ بالعينات النقية المتبقية على الثلج أو عند -20 درجة مئوية حتى خطوات أخرى.
    1. لحجم العينة < 50 ميكرولتر ، أضف الماء الخالي من RNase ليصل إلى 50 ميكرولتر. أضف 2 مجلدات من المخزن المؤقت لربط oligo (متوفر في المجموعة) إلى حجم 1 من العينة. أضف 8 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى حجم 1 من العينة.
    2. قم بتحميل العينة (حتى 750 ميكرولتر في المرة الواحدة) إلى عمود موضوع داخل أنبوب تجميع سعة 2 مل (متوفر في المجموعة). لربط الحمض النووي الريبي بالعمود ، قم بطرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق (أي السائل الموجود في أنبوب التجميع). ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع.
    3. لغسل الشوائب من العمود ، أضف 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي (المتوفر في المجموعة) إلى العمود. أجهزة الطرد المركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية وتجاهل التدفق. ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع.
    4. أجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة (على سبيل المثال ، 16000 × جم لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة الموضوعة على الطاولة) لمدة 1 دقيقة إضافية لإزالة المخزن المؤقت لغسيل الحمض النووي المتبقي.
    5. لاستئصال الحمض النووي الريبي ، انقل العمود بعناية إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل ، أضف الماء الخالي من RNase إلى العمود. استخدم حجما أكبر من اللازم عند استخلاص الحمض النووي الريبي لحساب فقدان الحجم المحتمل أثناء عملية الشطف. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى 15 ميكرولتر للخطوة التالية ، أضف 17 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase للشطف. أجهزة طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 30 ثانية.

3. إزالة مثيلات ما بعد النسخ بواسطة AlkB demethylase

ملاحظة: AlkB هو إنزيم بكتيري يزيل مجموعات الميثيل من بعض ، وليس كل ، النيوكليوتيدات الميثيلية في الحمض النووي والحمض النووي الريبي. إزالة عدة أنواع من الريبونوكليوتيدات الميثيلية في الحمض النووي الريبي يمنع سقوط النسخ العكسي للسماح بمزيد من القراءات الكاملة وتحديد مواقع التعديل. يجب التحكم في هذه الخطوة عند درجة حموضة منخفضة لمنع التدهور غير المتوقع للحمض النووي الريبي.

  1. تحضير محلول مخزون مقداره 1 M 2-ketoglutarate عن طريق إذابة 1.4611 جم من 2-كيتوغلوتارات (146.11 جم لكل م) في 10 مل من الماء الخالي من RNase. مرشح تعقيم الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بقسمة محلول المخزون في أنابيب معقمة سعة 2 مل وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد محلول مخزون من 0.5 M L-ascorbic acid عن طريق إذابة 0.88 g من حمض L-ascorbic (176.12 g per M) في 10 mL من الماء الخالي من RNase. مرشح تعقيم الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بقسمة محلول المخزون في أنابيب معقمة سعة 2 مل وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول مخزون من 0.25 M كبريتات الحديدوز الأمونيوم سداسي هيدرات عن طريق إذابة 0.9835 g من سداسي هيدرات كبريتات الحديدوز الأمونيوم (392.14 g لكل M) في 10 مل من الماء الخالي من RNase. مرشح تعقيم الحل من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بقسمة محلول المخزون في أنابيب معقمة سعة 2 مل وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد محلول مخزون مقداره 1 M HEPES عن طريق إذابة 2.383 جم من HEPES (238.30 جم لكل م) في 10 مل من الماء الخالي من RNase. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 8 باستخدام NaOH وقم بتعقيم المحلول من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بقسمة محلول المخزون في أنابيب معقمة سعة 2 مل وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  5. قم بإعداد مخزن مؤقت لتفاعل AlkB 2x. لصنع 10 مل من المخزن المؤقت ، ادمج 1.5 ميكرولتر من 1 M 2-ketoglutarate (صنع في الخطوة 3.1) ، 80 ميكرولتر من 0.5 M L-حمض الأسكوربيك (صنع في الخطوة 3.2) ، 6 ميكرولتر من 0.25 M كبريتات الحديدوز الأمونيوم سداسي هيدرات (صنع في الخطوة 3.3) ، 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل BSA ، 1000 ميكرولتر من 1 M HEPES (صنع في الخطوة 3.4 ؛ أضف الأخير) ، و 8812.5 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. مرشح تعقيم المخزن المؤقت من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
    ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت لتفاعل AlkB 2x طازجا مباشرة قبل كل تجربة بسبب المسؤولية الكيميائية للمكونات.
  6. قم بإعداد تفاعل هضم AlkB في أنبوب PCR معقم بإضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرتبط ب Linker-1 (منتجات من الخطوة 2) ، و 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل AlkB 2x (صنع في الخطوة 3.5) ، و 2 ميكرولتر من Demethylase AlkB ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase ، و 27 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
  7. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لإزالة مثيلات ما بعد النسخ من الحمض النووي الريبي.
  8. لإزالة AlkB من التفاعل ، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. لفصل الطور النظيف ، أضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase إلى تفاعل AlkB ، ثم أضف 100 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزو أميل 25:24: 1 (الرقم الهيدروجيني = 5.2).
    2. رج باليد لمدة 10 ثوان ، ثم استخدم جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق. تأكد من أن دوار جهاز الطرد المركزي الموجود على الطاولة متوافق مع أنابيب PCR. استخدم المحولات إذا لزم الأمر.
    3. نقل الحمض النووي الريبي (أي الطبقة المائية في الأعلى ؛ حوالي 140 ميكرولتر) إلى أنبوب معقم 1.5 مل. إذا تم خلط الكلوروفورم (أي الطبقة السفلية) في الطبقة المائية ، قم بطرد مركزي مرة أخرى بنفس الإعدادات.
    4. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الحمض النووي الريبي المستخرج لإزالة الفينول المتبقي. رج باليد لمدة 10 ثوان ، ثم استخدم جهاز طرد مركزي عند 16000 × جم لمدة 10 دقائق.
    5. نقل الحمض النووي الريبي (أي الطبقة المائية في الأعلى ؛ حوالي 120 ميكرولتر) إلى أنبوب معقم 1.5 مل.
  9. عمود تنقية الحمض النووي الريبي المستخرج. استخدم مجموعة لاستعادة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتنظيفه (انظر جدول المواد). اتبع البروتوكول المفصل في الخطوة 2.3 لإجراء تنقية العمود.

4. إزالة الرابط الزائد 1

ملاحظة: يوصى بحفظ قسمة (1.2 ميكرولتر) من كل عينة بعد التنقية. عند الضرورة ، يمكن استخدام هذه القسوم للتحقق من كفاءة هضم RecJf عن طريق تشغيل محلل الحمض النووي التجاري. تابع العينات المنقاة على الفور لعكس النسخ.

  1. قم بإعداد تفاعل إزالة الأدينيل في أنبوب PCR معقم بإضافة 15 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المرتبط ب Linker-1 (منتجات من الخطوة 3) ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase 40 U / μL ، و 2 ميكرولتر من 10x kit buffer 2 (انظر جدول المواد) ، و 2 ميكرولتر من 50 وحدة / ميكرولتر 5'-deadenylase.
  2. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإزالة الأدينين في نهاية 5' من الرابط 1. أضف 2 ميكرولتر من 30 U / μL RecJf في تفاعل إزالة الأدينيلات.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم الرابط 1 الزائد. أضف 2 ميكرولتر أخرى من 30 U / μL RecJf إلى التفاعل.
  4. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمواصلة هضم الزائد لينكر 1 ثم على 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتشويه الإنزيم.
  5. تنقية العمود الحمض النووي الريبي المرتبط ب Linker-1. استخدم مجموعة تستخدم تقنية الترشيح الهلامي لإزالة نهايات الصبغة من تفاعلات التسلسل (انظر جدول المواد) ، لأنها فعالة في إزالة البقايا القصيرة (على سبيل المثال ، oligonucleotides بطول 2 إلى 10 bp). اتبع الخطوات الموضحة أدناه للتنقية.
    1. قم بإعداد أعمدة مرشح الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ضع عمودا في أنبوب معقم سعة 1.5 mL وقم بتحميل العمود ب 24 ميكرولتر من العينة.
    2. لتنقية الحمض النووي الريبي ، أجهزة الطرد المركزي في 800 × غرام لمدة 3 دقائق وتجاهل العمود. الحمض النووي الريبي المنقى في الاستنباط.

5. تفاعل النسخ العكسي (RT)

ملاحظة: يتبع إعداد تفاعل RT (انظر جدول المواد) التالي بروتوكول الشركة المصنعة، مع تعديلات طفيفة للسماح بتوافق AQRNA-seq.

  1. قم بإعداد تفاعل التلدين التمهيدي RT في أنبوب PCR معقم عن طريق إضافة 24 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي القالب (منتجات من الخطوة 4) ، و 1 ميكرولتر من 2 ميكرومتر RT التمهيدي (الجدول 1) ، و 1 ميكرولتر من dNTP (10 مللي متر من كل نوع من النيوكليوتيدات).
  2. احتضان في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لتلدين RT الاشعال إلى قالب الحمض النووي الريبي ، ثم تبرد على الجليد على الفور لمدة 2 دقيقة.
  3. قم بإعداد تفاعل RT عن طريق إضافة 6 ميكرولتر من محلول تفاعل RT 5x ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase 40 وحدة / ميكرولتر ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي في أنبوب تفاعل التلدين.
  4. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لعكس نسخ قوالب الحمض النووي الريبي ، ثم عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل الإنزيم. يمكن تخزين منتجات RT (أي هجينة RNA-cDNA) عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية طوال الليل.

6. التحلل المائي للحمض النووي الريبي

  1. أضف 1 ميكرولتر من 5 M NaOH إلى هجين RNA-cDNA (منتجات من الخطوة 5). احتضان عند 93 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتحلل شريط الحمض النووي الريبي لهجين RNA-cDNA.
  2. أضف 0.77 ميكرولتر من 5 M HCl لتحييد التفاعل. بعد إضافة حمض الهيدروكلوريك ، نفض الغبار للخلط ، وقم بتدوير الأنبوب لأسفل. التحييد فوري.
    ملاحظة: يوصى باختبار الكمية الدقيقة من 5 M HCl اللازمة لتحييد 1 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم (على سبيل المثال ، باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني) في ظروف التخزين المؤقت.
  3. تنقية العمود cDNAs تقطعت بهم السبل. استخدم مجموعة لاستعادة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتنظيفه (انظر جدول المواد). اتبع البروتوكول المفصل في الخطوة 2.3 لإجراء تنقية العمود.
    ملاحظة: لا يمكن استخدام المجموعات التي تستخدم تقنية الترشيح الهلامي لإزالة نهايات الصبغة من تفاعلات التسلسل (انظر جدول المواد) هنا بسبب اختلاف الأس الهيدروجيني في الخطوات السابقة.
  4. قم بتفريغ cDNA المنقى بسرعة إلى < 5 ميكرولتر ثم أضف الماء الخالي من RNase لإعادة الحجم إلى 5 ميكرولتر. احرص على عدم تسريع cDNAs لإكمال الجفاف.
  5. نقل cDNAs المنقى إلى أنبوب PCR معقم. يمكن تخزين cDNAs المنقى في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.

7. ربط الرابط 2 بنهاية 3 'من cDNAs

  1. قم بإعداد تفاعل ربط Linker 2 في أنبوب PCR معقم بإضافة 5 ميكرولتر من cDNAs (منتجات من الخطوة 6) ، 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر Linker 2 (الجدول 1) ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase عازلة للتفاعل ، 1 ميكرولتر من 10 mM ATP ، 9 ميكرولتر من PEG8000 (محلول 50٪) ، و 2 ميكرولتر من 400 وحدة / ميكرولتر T4 DNA ligase.
    ملاحظة: يمكن تحويل الكواشف إلى مزيج رئيسي لتسهيل معالجة العينات. لا تقم بتضمين PEG8000 و T4 DNA ligase في المزيج الرئيسي.
  2. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لربط الرابط 2 بالحمض النووي cDNAs.
  3. تنقية العمود cDNAs المرتبطة ب Linker-2. استخدم مجموعة لاستعادة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتنظيفه (انظر جدول المواد). اتبع البروتوكول المفصل في الخطوة 2.3 لإجراء تنقية العمود.

8. إزالة الرابط الزائد 2

  1. قم بإعداد تفاعل إزالة الأدينيل في أنبوب PCR معقم عن طريق إضافة 16 ميكرولتر من cDNAs المرتبطة ب Linker-2 ، و 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة 10x 2 ، و 2 ميكرولتر من 50 وحدة / ميكرولتر 5'-deadenylase. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لإزالة الأدينين في نهاية 5' من لينكر 2.
  2. أضف 2 ميكرولتر من 30 U / μL RecJf في تفاعل إزالة الأدينيلات. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم الرابط 2 الزائد. أضف 2 ميكرولتر أخرى من 30 U / μL RecJf إلى التفاعل.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لمواصلة هضم لينكر 2 الزائد ثم على 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتشويه الإنزيم.

9. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي cDNA باستخدام التسلسل البادئات

  1. تعيين بادئات PCR للعينات. تحتاج كل عينة إلى مزيج فريد من البادئات الأمامية والخلفية (الجدول 1) لتعدد الإرسال الفعال.
  2. أضف الماء الخالي من RNase ليصل حجم العينة إلى 25 ميكرولتر. احفظ 5 ميكرولتر من كل عينة في أنبوب PCR معقم كنسخة احتياطية في حالة الحاجة إلى تكرار تفاعل البوليميراز المتسلسل.
  3. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر جدول المواد لمجموعة PCR) بإضافة 20 ميكرولتر من cDNAs (المنتجات من الخطوة 8) ، و 1 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر التمهيدي الأمامي ، و 1 ميكرولتر من 2.5 ميكرومتر التمهيدي العكسي ، و 25 ميكرولتر من 2x عازلة بوليميراز الحمض النووي ، و 2 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، و 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي.
    ملاحظة: يمكن تحويل الكواشف إلى مزيج رئيسي لتسهيل معالجة العينات. لا تقم بإضافة بوليميراز الحمض النووي إلى المزيج الرئيسي.
  4. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع تمسخ أولي عند 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، تليها 18 دورة من التمسخ عند 98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية - التلدين عند 58 درجة مئوية لمدة 20 ثانية - التمديد عند 68 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: لا تقم بتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل خارج النطاق الخطي. سيكون إجمالي 18 دورة هو الأمثل لمعظم التجارب ، ولكن قد يعتمد ذلك على السياق.
  5. قم بتفريغ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بسرعة إلى أقل من 25 ميكرولتر ثم أضف الماء الخالي من RNase لإعادة الحجم إلى 25 ميكرولتر. انقل 5 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنبوب معقم سعة 0.5 مل للتحقق من توزيع الحجم (انظر الخطوة 9.6). قم بتخزين 20 ميكرولتر المتبقية من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في -20 درجة مئوية حتى خطوات أخرى.
  6. تحقق من توزيع حجم منتجات PCR كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير 3 ٪ هلام الأغاروز في العازلة TAE.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يستخدم بروميد الإيثيديوم (EtBr) لتلطيخ هلام ما بعد الرحلان الكهربائي (انظر الخطوة 9.6.5). يمكن إضافة بقع الحمض النووي المناسبة إلى محلول الجل في هذه الخطوة أو استخدامها لتلطيخ الهلام لاحقا.
    2. امزج 1 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x في 5 ميكرولتر من منتجات PCR (من الخطوة 9.5) وقم بتحميل الجل بالخليط.
    3. قم بتحميل 5 ميكرولتر من سلالم الحمض النووي في البئر قبل العينة الأولى والبئر بعد العينة الأخيرة. استخدم سلالم الحمض النووي 50 bp أو 100 bp للسماح بتحسين تمييز حجم منتجات PCR بين 150 bp و 300 bp.
    4. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي الهلامي لتحديد موقع منتجات PCR. قد تعتمد حالة التشغيل المناسبة على السياق. هنا ، قم بتشغيل 120 فولت ، 400 مللي أمبير لمدة 75 دقيقة للوح جل 17.78 سم (عرض) × 10.16 سم (ارتفاع) × 1 سم (سمك).
    5. ضع الجل في صندوق واملأ الصندوق بالماء منزوع الأيونات (DI) حتى يتم غمر الجل تماما. أضف 10 ميكرولتر من EtBr إلى ماء DI لنقع الجل. لف الصندوق بورق ووضعه على شاكر. تلطيخ الجل لمدة 30 دقيقة أثناء الرج.
    6. تخلص من النفايات المحتوية على EtBr في زجاجة نفايات موضوعة في غطاء دخان. اشطف الجل بماء DI مرة واحدة وتخلص من الماء المحتوي على EtBr في زجاجة النفايات.
    7. املأ الصندوق بماء DI حتى يتم غمر الجل تماما. لف الصندوق بورق ووضعه على شاكر. اغسل الجل لمدة 10 دقائق أثناء الرج.
    8. تخلص من الماء المحتوي على EtBr في زجاجة النفايات في غطاء الدخان. استخدم جهاز تصوير جل لتصور الأساور. الحصول على صورة عالية الدقة من هلام.

10. تنقية هلام

  1. تحضير 3 ٪ هلام الأغاروز في العازلة TAE. اصنع هلاما بسمك 1 سم بأمشاط عريضة (سمك 1 مم ؛ عرض 5 مم ؛ عمق 15 مم) ، بحيث يمكن أن يحتوي كل بئر على 25 ميكرولتر على الأقل من خليط صبغة تحميل العينات.
  2. امزج 4 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x مع 20 ميكرولتر من منتجات PCR (من الخطوة 9.5) وقم بتحميل الجل بالخليط. اترك الممرات الفارغة بين العينات لتقليل التلوث المتبادل أثناء استئصال الجل.
  3. قم بتحميل سلالم الحمض النووي ، وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام ، وقم بتلطيخ الجل وغسله ، والتقط صورا للهلام كما هو موضح في الخطوة 9.6.
  4. قم باستئصال كتل الجل التي تحتوي على منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ضمن نطاق الحجم المستهدف. لتقليل التلوث باستخدام دايمرات التمهيدي (وصلات 175 نقطة أساس بدون إدراجات) ، قم باستخراج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم أعلى من 195 نقطة أساس (روابط 175 نقطة أساس + 20 نقطة أساس miRNAs).
  5. تنقية منتجات PCR باستخدام استخراج الجل. استخدم مجموعة أدوات استخراج الجل (انظر جدول المواد). يعتمد بروتوكول التنقية على بروتوكول الشركة المصنعة ، مع تعديلات طفيفة لتوافق AQRNA-seq. يجب إجراء جميع خطوات الطرد المركزي عند 17,900 × جم لمدة 1 دقيقة باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة في درجة حرارة الغرفة ، ما لم ينص على خلاف ذلك. اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
    1. قياس وزن كتل هلام داخل الأنابيب. أضف 6 مجلدات من Buffer QG (المتوفرة في المجموعة) إلى حجم واحد من كتلة الهلام (1 ملغ جل حوالي 1 ميكرولتر).
    2. احتضان على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى الذوبان الكامل للكتل الهلامية. أنابيب دوامة كل 2 دقيقة لتسهيل إذابة الهلام. بعد إذابة الجل ، يجب أن يشبه الخليط لون Buffer QG بدون الجل المذاب. إذا كان اللون برتقاليا أو بنفسجيا ، أضف 10 ميكرولتر من 3 M أسيتات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني = 5.0) واخلطه جيدا.
    3. إضافة 1 حجم هلام من الأيزوبروبانول إلى الخليط وتخلط جيدا. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع سعة 2 مل (متوفر في المجموعة).
    4. لربط الحمض النووي ، ضع العينة (حتى 750 ميكرولتر في كل مرة) على العمود وأجهزة الطرد المركزي. تخلص من التدفق من خلاله وضع العمود مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. الحد الأقصى لكمية الجل لكل عمود دوران هو 400 ملغ.
    5. أضف 500 ميكرولتر من Buffer QG إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي. تخلص من التدفق من خلاله وضع العمود مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    6. لغسل الشوائب ، أضف 750 ميكرولتر من Buffer PE (المتوفرة في المجموعة) إلى العمود ، واترك العمود يقف لمدة 5 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي. تخلص من التدفق من خلاله وضع العمود مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لإزالة العازلة الغسيل المتبقية.
    7. ضع العمود في أنبوب معقم سعة 1.5 مل. لإذابة الحمض النووي ، أضف 30 ميكرولتر من Buffer EB (المتوفرة في المجموعة) إلى مركز غشاء العمود ، واترك العمود يقف لمدة 4 دقائق ، وأجهزة الطرد المركزي.
    8. قم بتفريغ وإعادة تعليق منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى بالهلام في 12 ميكرولتر من Buffer EB.
  6. قياس تركيز المكتبات المبنية عن طريق القياس الطيفي المرئي للأشعة فوق البنفسجية و / أو القياس الكمي الفلورومتري.

11. تسلسل المكتبة

  1. تقديم المكتبات التي تم إنشاؤها إلى مركز تسلسل خارجي لتقييم الجودة وتسلسل Illumina. لضمان الحساسية الكافية في رسم الخرائط الكمية لمناظر الحمض النووي الريبي الصغيرة ، اختر التسلسل المزدوج مع قراءات 75 نقطة أساس من كل اتجاه (أي PE75) ، بهدف قراءة تسلسل خام 1.5 متر على الأقل في كل اتجاه لكل عينة. استخدم الاشعال المخصصة (الجدول 1) لتسلسل NextSeq ، ولكن هذا اختياري للتسلسل على MiSeq.
    ملاحظة: يمكن إجراء التسلسل باستخدام منصات MiSeq أو NextSeq500. قد يعتمد اختيار المنصة على طبيعة العينات وإجمالي عدد العينات.

12. خط أنابيب تحليلات البيانات

ملاحظة: يقدم الشكل 2 توضيحا بيانيا للإجراءات المبسطة المتضمنة في خط أنابيب تحليلات البيانات ، والذي يأخذ قراءات التسلسل الخام (بتنسيق FASTQ) كمدخلات ويولد مصفوفة وفرة مع صفوف تمثل أعضاء أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة ذات الأهمية وأعمدة تمثل العينات. بالنسبة للتسلسل المقترن ، تتوافق كل عينة مع ملفين FASTQ ، أحدهما للقراءات الأمامية والآخر للقراءات العكسية. يتوفر خط أنابيب تحليلات البيانات الكامل ، مع جميع البرامج النصية المرتبطة به ودليل مع تعليقات توضيحية شاملة لكل خطوة ، على GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

  1. استرجع قراءات التسلسل الخام من مركز التسلسل الخارجي وقم بتقييم جودة التسلسل باستخدام برامج مفتوحة المصدر مثل FastQC14 أو fastp15.
  2. إنشاء مكتبة تسلسل مرجعية بتنسيق FASTA.
    ملاحظة: مفتاح قدرة خط الأنابيب على التكيف مع فئات الحمض النووي الريبي الصغيرة المتنوعة هو مكتبة تسلسل مرجعية مناسبة. لتحقيق تقديرات دقيقة للوفرة لأعضاء فئات محددة من الحمض النووي الريبي ذات الأهمية (على سبيل المثال ، miRNA) ، يتوقع من المستخدمين تنظيم مكتبة تسلسل مرجعية بدقة لاستخدامها مع خط الأنابيب. تظل جميع التعليمات الأخرى لتنفيذ خطوط الأنابيب متسقة عبر فئات الحمض النووي الريبي الصغيرة المختلفة.
  3. قم بإنشاء دليل باسم AQRNA-seq لتنفيذ خط أنابيب تحليلات البيانات ووضع جميع البرامج النصية وقراءات التسلسل التي تمت تصفيتها بجودة الجودة ومكتبة التسلسل المرجعي في هذا الدليل. اتبع التعليمات التفصيلية على GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) لإعداد الدلائل الفرعية وإجراء التعديلات الأساسية على الملفات لاستهداف الكائنات الحية المختلفة و / أو أنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة ، بالإضافة إلى توافق نظام التشغيل و / أو جدولة المهام.
  4. قم بتنفيذ مسار تحليلات البيانات باتباع الخطوات الموضحة في الدليل على GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) ، والذي يحتوي على الأوصاف وملفات الإدخال والإخراج ، بالإضافة إلى سطور الأوامر لكل خطوة. باختصار ، يشمل خط الأنابيب (i) تقليم تسلسلات الروابط والنيوكليوتيدات العشوائية من القراءات ، (ii) تصفية القراءات بناء على طولها ، (iii) تعيين القراءات إلى التسلسلات المرجعية ، (iv) حل التعيينات الغامضة ، و (v) توليد مصفوفة الوفرة.

النتائج

المتفطرة البوفية خضعت سلالة BCG (عصيات كالميت وغيرين) 1173P2 التي تخضع لنمو أسي لسلسلة زمنية (0 و 4 و 10 و 20 يوما) من تجويع المغذيات ، تليها إنعاش لمدة 6 أيام في وسط غني بالمغذيات كما تم تقديمه سابقا في Hu et al.7. تم عزل الحمض النووي الريبي الصغير من الثقافة البكتيرية ، مع ثلاثة تكرارات...

Discussion

تم تصميم سير عمل إعداد مكتبة AQRNA-seq لزيادة التقاط الحمض النووي الريبي داخل العينة وتقليل سقوط البلمرة أثناء النسخ العكسي7. من خلال ربط رابط من خطوتين ، يتم ربط oligos DNA الجديد (Linker 1 و Linker 2) بشكل زائد لاستكمال الحمض النووي الريبي بالكامل داخل العينة. يمكن إزالة الروابط الزائدة بكفا?...

Disclosures

P.C.D. مخترع على براءتي اختراع (PCT / US2019 / 013714 ، US 2019/0284624 A1) تتعلقان بالعمل المنشور.

Acknowledgements

يعرب مؤلفو هذا العمل عن امتنانهم لمؤلفي الورقة الأصلية التي تصف تقنية AQRNA-seq7. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (ES002109 ، AG063341 ، ES031576 ، ES031529 ، ES026856) والمؤسسة الوطنية للبحوث في سنغافورة من خلال تحالف سنغافورة ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للبحث والتكنولوجيا مقاومة مضادات الميكروبات IRG.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-ketoglutarate Sigma-Aldrich75890Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England BiolabsM0437M (component #: N0437AVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LEAmericanBioAB00972-00500Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrateSigma-AldrichF2262Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA AnalysisAgilent5067-1548 The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) New England BiolabsB9000This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform Macron Fine Chemicals4441-10
Demethylase ArrayStarAS-FS-004Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447L (component #: N0447LVIAL)This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat BlockVWR Scientific Products13259-052Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen63204 Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power SupplyBio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)Eppendorf0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)Eppendorf022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)Eppendorf022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)Eppendorf022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), PureSigma-AldrichE7023 The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging SystemAlpha InnotechFluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDSNew England BiolabsN0556S (component #: B7025SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific840-309000The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPESSigma-AldrichH4034Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) VWR Scientific ProductsBDH3028 Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), PureMacron Fine Chemicals3032-16Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
L-Ascorbic acidSigma-AldrichA5960Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
MicrocentrifugeEppendorf5415D
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
NEBuffer 2 (10X)New England BiolabsM0264L (component #: B7002SVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)Thermo Fisher ScientificAM9938 
Oligo Clean & Concentrator Kit Zymo ResearchD4061 Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution) New England BiolabsM0437M (component #: B1004SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal CyclerMJ ResearchPTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 Thermo Fisher ScientificJ62336 
PrimeScript Buffer (5X)TaKaRa2680A 
PrimeScript Reverse TranscriptaseTaKaRa2680A 
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen28704This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderNew England BiolabsN0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderNew England BiolabsN0556S (component #: N0556SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL) New England BiolabsM0264L (component #: M0264LVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) New England BiolabsM0314L (component #: M0314LVIAL)Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X) TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) New England BiolabsM0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich S5881Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL) New England BiolabsM0202L (component #: M0202LVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0202L (component #: B0202SVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) New England BiolabsM0437M (component #: M0437MVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0437M (component #: B0216SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)

References

  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).
  3. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  4. Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
  5. Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
  6. Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).
  7. Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
  8. Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
  9. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).
  10. Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).
  11. Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
  12. Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
  13. García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).
  14. . FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
  15. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  16. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  17. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2022).
  18. Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
  19. Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4 (2012).
  20. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  21. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

AQRNA seq BCG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved