عزل الطفرات التفاعلية الفارغة / الضعيفة باستخدام مقايسة الخميرة ثنائية الهجين

Summary

تفاعلات الجزيئات الحيوية ، مثل تفاعلات البروتين والبروتين ، هي الأساس الجزيئي للوظائف البيولوجية. إذا كان من الممكن عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة التي تفتقر على وجه التحديد إلى التفاعل ذي الصلة ، فإنها ستساعد بشكل كبير على فهم وظيفة (وظائف) هذا التفاعل. تقدم هذه المقالة طريقة فعالة لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة.

Abstract

التفاعلات بين البروتين والبروتين هي واحدة من العمليات الأساسية التي تكمن وراء الظواهر البيولوجية. واحدة من أبسط وأفضل الطرق لفهم دور (أدوار) ووظيفة (وظائف) تفاعل معين بين البروتين والبروتين هي مقارنة النمط الظاهري للنوع البري (مع تفاعل البروتين والبروتين ذي الصلة) وتلك الخاصة بالطفرات التي تفتقر إلى التفاعل ذي الصلة. لذلك ، إذا كان من الممكن عزل هذه الطفرات ، فإنها ستساعد على توضيح العمليات البيولوجية ذات الصلة. يعد إجراء الخميرة ثنائي الهجين (Y2H) نهجا قويا ليس فقط للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين ولكن أيضا لعزل الطفرات الخالية / الضعيفة. في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول لعزل طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة باستخدام تقنية Y2H. أولا ، يتم إنشاء مكتبة الطفرات من خلال الجمع بين تفاعل البلمرة المتسلسل وتقنية الاستنساخ غير الملحومة الفعالة ، والتي تستبعد بكفاءة المتجه الفارغ من المكتبة. ثانيا ، يتم فحص طفرات التفاعل الفارغة / الضعيفة بواسطة مقايسة Y2H. بسبب خدعة في ناقل Y2H ، يتم التخلص بكفاءة من الطفرات غير المرغوب فيها ، مثل تلك التي تحتوي على طفرات في الإطار وهراء ، من عملية الفحص. هذه الاستراتيجية بسيطة ويمكن تطبيقها على أي مجموعة من البروتينات التي يمكن اكتشاف تفاعلها بواسطة النظام الهجين.

Introduction

التفاعلات بين الجزيئات الحيوية هي الجزء الأساسي من الظواهر البيولوجية. تشكل تفاعلات البروتين والبروتين جزءا مهما من هذه التفاعلات. لذلك ، فإن تحديد شريك (شركاء) التفاعل للبروتين محل الاهتمام أمر بالغ الأهمية لزيادة توضيح وظيفة البروتين / الجين محل الاهتمام. طريقة الخميرة ثنائية الهجين (Y2H) هي تقنية شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين في الجسم الحي¹. في هذا النظام ، يتم دمج اثنين من البروتينات (X و Y) التي سيتم اختبار تفاعلها في مجال ربط الحمض النووي (DB) ومجال تنشيط النسخ (AD) ، على التوالي. يرتبط بروتين الاندماج DB-X بتسلسل التعرف على مجال DB ؛ لذلك ، عندما يتفاعل البروتينان X و Y ، يقترب بروتين الاندماج AD-Y من تسلسل التعرف. وبا....

Protocol

1. بناء مكتبة المسخ

1. قم بإعداد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) (يظهر مثال أدناه). بشكل عام ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من التفاعل ، والذي ينقسم إلى عشرة حصص من 5 ميكرولتر ، وتضخيم جزء الجين المستهدف في جهاز PCR⁴.
   ملاحظة: يجب على المستخدمين اختيار بوليميراز مناسب لإدخال الطفرات بكفاءة. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه قصيرا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز بمعدل خطأ أعلى ، مثل Taq polymerase ، الذي يفتقر إلى نشاط التدقيق اللغوي. إذا كان جزء الحمض النووي المراد تضخيمه طويلا ، فستكون هناك حاجة إلى بوليميراز أعلى دقة لتقليل عدد الطفرات. تحدث الطفرات كل بضع مئات من أزواج القواعد بعد 30 دورة من التضخيم باستخدام Taq polymer....

النتائج

في الآونة الأخيرة ، وجد أن النصف الطرفي C من بروتين Pol2 (Pol2-C) يتفاعل مع Mcm10. كلا البروتينين ضروريان لبدء تكرار الحمض النووي ، وبالتالي لنمو الخلايا في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae^13،14،15. للمساعدة في فهم الأهمية البيولوجية لهذا التفاعل ?.......

Discussion

توضح هذه المقالة كيفية عزل طفرات التفاعل الخالية / الضعيفة باستخدام مقايسة Y2H. هذه المسوخ هي أدوات قوية لتحليل وظيفة البروتين محل الاهتمام. لعزل هذه الطفرات ، تم تطوير فحوصات rY2H سابقا عن طريق تعديل سلالة مضيف Y2H ^2,3. ومع ذلك ، فإنها لم تقلل بشكل كبير من كمية الع?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (8.0)	Nacalai Tesque Inc.	14347-21
10% SDS Solution	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	313-90275
2-mercaptoethanol	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	135-07522
2-propanol	Kishida Chemical Co. Ltd.	110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	021-07852
Agar	Formedium	AGR60
Ampicillin Sodium	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.	M180-7
DNA from salmon testes	Merck KGaA.	D1626
Ethanol	Merck KGaA.	9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)	Whatman, Cytiva	1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	00011150
G-418 Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	075-05962
Hydrochloric acid	Kishida Chemical Co. Ltd.	230-37585
KCl	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	163-03545
Lithium Acetate Dihydrate	Nacalai Tesque Inc.	20604-22
MgSO4•7H2O	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	131-00405
Na2HPO4•12H2O	Nacalai Tesque Inc.	10039-32-4
NaCl	Nacalai Tesque Inc.	31319-45
NaH2PO4•2H2O	Nacalai Tesque Inc.	31717-25
Paper towel	AS ONE Corp.	7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	Nacalai Tesque Inc.	25970-56
Plasmid DNAs	the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation Kit	Nippon Genetics Co. Ltd.	FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000	Nacalai Tesque Inc.	11574-15
SC double drop-out mix -Leu -Trp	Formedium	DSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )	Takara Bio Inc.	#639648
Skim milk powder	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	190-12865
Streptomycin Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)	Promega Corp.	M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane	Formedium	TRIS01
Triton X-100	Nacalai Tesque Inc.	12967-45
Tryptone	ThermoFisher scientific Inc.	211705
Tween 20	Nacalai Tesque Inc.	35624-15
Yeast Extract	ThermoFisher scientific Inc.	212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)	Formedium	CYN0210
Zymolyase 100T	Nacalai Tesque Inc.	07665-55