JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

يقدم هذا البروتوكول نموذجا معدلا للفأر لإصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكررة (rmTBI) الناتجة عن طريق طريقة إصابة الرأس المغلقة (CHI). يتميز النهج بنافذة جمجمة رقيقة وقرع سائل لتقليل الالتهاب الذي يسببه عادة التعرض للسحايا ، إلى جانب تحسين قابلية التكاثر والدقة في نمذجة rmTBI في القوارض.

Abstract

إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة هي اضطراب عصبي غير متجانس للغاية سريريا. هناك حاجة ماسة إلى نماذج حيوانية لإصابات الدماغ الرضحية (TBI) قابلة للتكرار للغاية مع أمراض محددة جيدا لدراسة آليات علم الأمراض العصبية بعد إصابات الدماغ الرضية الخفيفة واختبار العلاجات. وقد ثبت أن تكرار العواقب الكاملة لإصابات الدماغ الرضية في النماذج الحيوانية يمثل تحديا. لذلك ، فإن توافر نماذج حيوانية متعددة من إصابات الدماغ الرضية ضروري لمراعاة الجوانب والشدة المتنوعة التي شوهدت في مرضى إصابات الدماغ الرضية. CHI هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتصنيع نماذج القوارض من rmTBI. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة عرضة للعديد من العوامل ، بما في ذلك طريقة التأثير المستخدمة ، وسمك وشكل عظم الجمجمة ، وتوقف التنفس أثناء ، ونوع دعم الرأس والشلل المستخدم. الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار مزيج من نافذة الجمجمة الرقيقة وطرق إصابة قرع السوائل (FPI) لإنتاج نموذج فأر دقيق ل rmTBI المرتبط ب CHI. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو تقليل العوامل التي يمكن أن تؤثر على دقة واتساق نمذجة CHI و FPI ، بما في ذلك سمك عظم الجمجمة والشكل ودعم الرأس. من خلال استخدام طريقة نافذة الجمجمة الرقيقة ، يتم تقليل الالتهاب المحتمل بسبب حج القحف و FPI ، مما يؤدي إلى تحسين نموذج الماوس الذي يكرر السمات السريرية التي لوحظت في المرضى الذين يعانون من إصابات الدماغ الرضية الخفيفة. تشير نتائج التحليل السلوكي والنسيجي باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) إلى أن rmTBI يمكن أن يؤدي إلى إصابة تراكمية تنتج تغييرات في كل من السلوك والتشكل الإجمالي للدماغ. بشكل عام ، يقدم rmTBI المعدل المرتبط ب CHI أداة مفيدة للباحثين لاستكشاف الآليات الأساسية التي تساهم في التغيرات الفيزيولوجية المرضية البؤرية والمنتشرة في rmTBI.

Introduction

تمثل إصابات الدماغ الرضية الخفيفة، بما في ذلك الارتجاج والارتجاج الفرعي، غالبية جميع حالات إصابات الدماغ الرضية (>80٪ من جميع إصابات الدماغ الرضية)1. عادة ما ينتج إصابات الدماغ الرضية الخفيفة عن السقوط وحوادث المرور وأعمال العنف والرياضات التي تتطلب الاحتكاك (مثل كرة القدم والملاكمة والهوكي) والقتال العسكري 2,3. يمكن أن يؤدي TBI الخفيف إلى أحداث بيولوجية عصبية تؤثر على الوظائف السلوكية العصبية طوال حياة المريض وتزيد من خطر الإصابة بالأمراض التنكسية العصبية4،5،6. توفر النماذج الحيوانية وسيلة فعالة ومضبوطة لدراسة إصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، على أمل زيادة تعزيز تشخيص وعلاج إصابات الدماغ الرضية الخفيفة. تم تطوير نماذج مختلفة لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، مثل التأثير القشري المتحكم فيه (CCI) ، وانخفاض الوزن (WD) ، وإصابة قرع السوائل (FPI) ، ونماذج TBIالانفجار 7,8. لا يوجد نموذج تجريبي واحد يمكن أن يحاكي التعقيد الكامل لعلم الأمراض الناجم عن إصابات الدماغ الرضية 9,10. يعد عدم تجانس هذه النماذج مفيدا لمعالجة السمات المتنوعة المرتبطة بمرضى إصابات الدماغ الرضية الخفيفة والتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية المقابلة. ومع ذلك ، فإن كل نموذج حيواني من إصابات الدماغ الرضية له حدوده3 ، مما يحد من معرفتنا الحالية فيما يتعلق بإصابات الدماغ الرضية الخفيفة الحيوانية وأهميتها السريرية.

يتم استخدام نماذج WD و CCI لتكرار الحالات السريرية مثل فقدان الأنسجة الدماغية ، والورم الدموي الحاد تحت الجافية ، والإصابة المحورية ، وارتجاج الدماغ ، وخلل الحاجز الدموي الدماغي ، وحتى الغيبوبة بعد TBI3،11،12. يتضمن نموذج WD إحداث تلف في الدماغ عن طريق ضرب الأم الجافية أو الجمجمة بأوزان تسقط بحرية. يمكن أن يؤدي تأثير جسم مرجح على جمجمة سليمة إلى تكرار الإصابات البؤرية / المنتشرة المختلطة. ومع ذلك ، ترتبط هذه الطريقة بضعف الدقة والتكرار في موقع الإصابة ، وإصابة الارتداد ، وارتفاع معدل الوفيات بسبب كسور الجمجمة3،11،12. يتضمن نموذج CCI تطبيق معدن يحركه الهواء للتأثير على الأم الجافية المكشوفة مباشرة. بالمقارنة مع طراز WD ، فإن طراز CCI أكثر دقة وقابلية للتكرار ، لكنه لا ينتج عنه إصابة منتشرة بسبب القطر الصغير للطرف المتأثر11. أثناء نمذجة FPI ، يتم إزاحة أنسجة المخ لفترة وجيزة وتشوهها عن طريق الإيقاع. يمكن أن يؤدي FPI إلى إصابة بؤرية / منتشرة مختلطة وتكرار النزيف داخل الجمجمة وتورم الدماغ وتلف المادة الرمادية التدريجي بعد إصابات الدماغ الرضية. ومع ذلك ، فإن FPI لديها معدل وفيات مرتفع بسبب تلف جذع الدماغ وانقطاع النفس المطول 3,12. يمكن أن يؤدي حج القحف المتضمن في نماذج WD و CCI و FPI التقليدية إلى كدمة قشرية ، وآفات نزفية ، وتلف الحاجز الدموي الدماغي ، وتسلل الخلايا المناعية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، ووقت النمذجة المطول ، والنتائج المميتة المحتملة 3,12.

يتميز TBI الخفيف بدرجة GCS (مقياس غلاسكو للغيبوبة ، GCS) في حدود 13 إلى 152. يمكن أن يكون TBI الخفيف إما بؤريا أو منتشرا ويرتبط بكل من الإصابات الحادة ، مثل انهيار التوازن الخلوي ، والسمية المثيرة ، ونضوب الجلوكوز ، وضعف الميتوكوندريا ، واضطراب تدفق الدم ، وتلف المحور العصبي ، وكذلك الإصابات تحت الحادة ، بما في ذلك تلف المحور العصبي ، والتهاب الأعصاب ، والتسمم 2,3. على الرغم من التقدم الكبير في تحديد الفيزيولوجيا المرضية المعقدة لإصابات الدماغ الرضية ، فإن الآليات الأساسية لإصابات الدماغ الرضية الخفيفة / إصابات الدماغ الرضية لا تزال بعيدة المنال وتتطلب مزيدا من التحقيق9. بالنظر إلى أن CHI هو النوع الأكثر شيوعا من TBI12 ، يقدم هذا البروتوكول نهجا جديدا لإنشاء نموذج ماوس يتم التحكم فيه بدقة أكبر من rmTBI باستخدام جهاز FPI معدل لأداء التأثير في نافذة الجمجمة الرقيقة13. من خلال تجنب الإصابات الناجمة عن حج القحف ، وسمك الجمجمة المتغير وعدم الدقة التي يسببها الشكل ، وإصابة الارتداد ، يهدف هذا النهج إلى التغلب على العيوب الرئيسية المرتبطة بنماذج WD و CCI و PPI. يعد تطبيق تأثير FPI على نافذة الجمجمة الرقيقة مناسبا لتقييم تلف الأوعية الدماغية بعد rmTBI ويساعد على تقليل معدلات الوفيات المرتفعة في بعض النماذج ، مما يؤدي إلى تشابه أقرب مع السمات السريرية لمرضى إصابات الدماغ الرضية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتضمنة في هذا البروتوكول بموجب موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (جامعة تشجيانغ للمعلمين ، رقم التصريح ، dw2019005) وامتثالا ل REACH ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يمكن العثور على المواصفات الفنية في جدول المواد.

1. إجراءات التعامل مع

  1. الفئران المنزلية في بيئة خاضعة للرقابة مع درجة حرارة 22-24 درجة مئوية ، والرطوبة تتراوح بين 40 ٪ -60 ٪ ، ودورة الضوء / الظلام 12 ساعة ، وتوفير الوصول إلى المياه وتشاو الماوس القياسية. لغرض هذه التجربة ، تم استخدام 25 من ذكور الفئران ICR (25-30 جم ، 8 أسابيع).
  2. قم بتخصيص الفئران عشوائيا إما في المجموعة الضابطة (n = 12) أو مجموعة rmTBI (n = 13). لمنع العدوان المحتمل من الفئران الوهمية تجاه الفئران التي خضعت ل rmTBI ، افصلها في أقفاص متميزة.
  3. إعطاء الفئران ما لا يقل عن 1 أسبوع للتأقلم مع بيئة قفصهم قبل البدء في التجربة. تضمن فترة التأقلم هذه أن تصبح الفئران على دراية بمحيطها وتقلل من الآثار المحتملة للتوتر أو القلق على الاستجابات الفسيولوجية أو السلوكية أثناء الدراسة.

2. إعداد جهاز TBI

  1. تصنيع نموذج rmTBI في الفئران باستخدام جهاز FPI معدل (انظر جدول المواد; الشكل 1 أ) 13. قبل استخدام جهاز FPI ، افحص بعناية جميع التوصيلات بحثا عن علامات التسرب أو التشقق ، مع إيلاء اهتمام خاص للتقاطعات بين الأسطوانة والأنبوب ، وبين الموصل ثلاثي الاتجاهات والأنبوب. لتحديد ضغوط التأثير بدقة ، تم تركيب محول ضغط إلى نقطة التأثير على جهاز إصابة قرع السوائل13.
  2. قم بإجراء فحص دقيق لجهاز FPI للتأكد من أن المكبس يتحرك بسلاسة داخل الأسطوانة وأنه يمكن إجراء التأثيرات بشكل فعال (الشكل 1 ب). تحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل النظام. إذا تم اكتشاف فقاعات هواء ، أضف الماء المقطر بعناية إلى النظام باستخدام حقنة سعة 50 مل واطرد فقاعات الهواء عن طريق دفع قضيب الأسطوانة بسرعة عبر موصل قريب من 3 اتجاهات و / أو من خلال المحقنة.
    ملاحظة: يتكون نظام FPI من الماء المقطر داخل الأسطوانة والأنابيب المتصلة. من الضروري معايرة الجهاز قبل التشغيل لضمان دقة النتائج وموثوقيتها.

3. إعداد الجمجمة الرقيقة

ملاحظة: لا ينبغي إجراء جراحة وإعداد الجمجمة الرقيقة في ضوء الفئران الأخرى. نافذة الجمجمة الرقيقة مفيدة لتقييم تلف الأوعية الدماغية بعد إجراء FPI.

  1. الالتزام بمتطلبات مركز من خلال توجيه المشغل التجريبي لارتداء رداء وقناع معقم أثناء جميع إجراءات التعامل مع.
  2. قم بتعقيم سطح طاولة المختبر وجهاز FPI وأنابيب التخدير ومساحة العداد المجاورة قبل بدء التجربة باستخدام رذاذ الإيثانول بنسبة 70٪.
  3. وزن الفئران في كل من مجموعات وهمية و rmTBI قبل الجراحة ومقارنة أوزانهم مع تلك المسجلة 1 أسبوع قبل التجربة. استبعد من الدراسة أي فأر يظهر صحة سيئة مثل معطف الفرو الخشن أو الإسهال أو فقدان الوزن أو الخمول. بالإضافة إلى ذلك ، استبعد الفئران التي يقل وزنها عن 20 جراما لضمان قدرتها على تحمل التأثيرات المتكررة. هذه التدابير حاسمة في الحفاظ على رعاية وضمان نتائج تجريبية موثوقة.
  4. تخدير الفئران باستخدام 4٪ -5٪ إيزوفلوران (في أكسجين 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة) لمدة 3-4 دقائق في غرفة الحث. إدارة مادة تشحيم للعيون (انظر جدول المواد) لعيون للحفاظ على التشحيم طوال الجراحة. لتخفيف الألم، يتم تطبيق البوبرينورفين تحت الجلد (0.05 ملغ/كغ) عند نقطة المنتصف بين الأذنين قبل 20 دقيقة من التخدير وبعد ذلك كل 6 ساعات لمدة 24 ساعة. علاوة على ذلك، في نهاية التخدير، يتم تطبيق جرعة واحدة تحت الجلد من 5 ملغ/كغ كاربروفين لكل.
  5. تطهير الرأس بعد أن يفقد الماوس ردود الفعل تصحيح وسحب دواسة. تقليم الفراء على رأس الماوس باستخدام مقص جراحي واستخدام ماكينة حلاقة لإزالة الفراء المتبقي. تطهير فروة الرأس مع ثلاثة تطبيقات متسلسلة من الكلورهيكسيدين 2 ٪ ، تتخللها 75 ٪ الدعك الإيثانول.
  6. ضع وسادة جراحية معقمة يمكن التخلص منها تحت والمنطقة المحيطة به لضمان النظافة المناسبة. قم بعمل شق 1.5 سم باستخدام مقص جراحي صغير ناعم على طول خط الوسط لفروة رأس الفأر لكشف موقع الجراحة بالكامل (الشكل 2 أ).
  7. قم بتأمين الماوس باستخدام قضبان الأذن غير الطرفية في إطار تجسيمي تقليدي (انظر جدول المواد). اضبط موضع رأس الماوس في إطار مجسم على مستوى مسطح أو زاوية مائلة طفيفة وفقا للمنطقة المستهدفة المحددة التي سيتم فحصها. نظف الفراء من منطقة الجراحة لتجنب الالتهاب لاحقا.
  8. حافظ على درجة حرارة جسم الماوس عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين تقليدية متساوية الحرارة (انظر جدول المواد).
  9. أثناء عملية تركيب محور الجراحة والتأثير (أنثى Luer Lock) ، حافظ على تخدير الماوس (دون استجابة لقرصة إصبع القدم أو الذيل) باستخدام مخروط الأنف الذي يوفر تركيزا مستمرا بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران ، يتم تنظيمه بواسطة مبخر معاير.
  10. نظف المنطقة الجراحية حول نافذة الجمجمة الرقيقة بعناية باستخدام قطعة قطن معقمة مبللة بالمحلول الملحي.
  11. قم بإنشاء نافذة جمجمة رفيعة ، قطرها حوالي 2.5 مم وسمكها 20 ميكرومتر ، في القشرة الحركية الأمامية اليمنى باستخدام مثقاب دقيق مسطح الرأس (انظر جدول المواد ، الشكل 2 ب) وشفرة جراحية مجهرية. حدد موقع الجراحة عند 1.5 مم أمام البريغما و 1.3-2.0 مم جانبي لخط الوسط (الشكل 2 ج).
    1. لمنع المثقاب الصغير من اختراق الجمجمة أثناء إنشاء نافذة الجمجمة الرقيقة ، قم بترطيب الجمجمة بشكل متقطع بالمحلول الملحي أثناء الطحن باستخدام المثقاب الصغير.
    2. تأكد من سمك الجمجمة عن طريق فحص الجمجمة الرقيقة برفق باستخدام الطرف المسطح لإبرة حقنة دقيقة وتقييم نعومتها. تقدير وضوح الأوعية الدقيقة القشرية المكشوفة بصريا لتحديد سمك الجمجمة.
    3. للتحقق من سمك الجمجمة ، ضع محلول ملحي معقم على المنطقة الرقيقة وافحصه بصريا باستخدام مجهر تشريح تقليدي (انظر جدول المواد). يمكن أن تساعد هذه التقنية في ضمان ترقق الجمجمة بشكل كاف.
      ملاحظة: قم بتليين عين الماوس طوال فترة تحضير الجمجمة الرقيقة بالكامل وإجراء نمذجة rmTBI لمنع الجفاف. إن ترقق الجمجمة إلى أقل من 15 ميكرومتر ينطوي على خطر الإصابة بصدمة قشرية خفيفة قد تؤدي إلى التهاب قشري خفيف14.
  12. قم بتوصيل قفل Luer الأنثوي المعدل (قطره الداخلي 2.2 مم ، تم إنشاؤه من محور إبرة 19G ، كما هو موضح في الشكل 2D) بموقع الجمجمة الرقيق. قم بتأمين قفل Luer بالغراء وأسمنت الأسنان (الشكل 2E).
    ملاحظة: عند استخدام الغراء لتثبيت قفل Luer الأنثوي في المنطقة المحيطة بنافذة الجمجمة الرقيقة ، من الضروري تجفيف منطقة الجمجمة تماما ومنع المادة اللاصقة من دخول النافذة نفسها. يمكن أن يقلل اللاصق داخل النافذة بشكل كبير من قوة تأثير FPI.

4. إجراء نمذجة rmTBI المرتبط ب CHI

  1. أدخل rmTBI باستخدام طريقة قرع السائل الجانبي مع جهاز FPI معدل كما هو موضح سابقا13,15.
  2. بعد الانتهاء من نافذة الجمجمة الرقيقة وإجراءات محور التأثير ، انقل الماوس من جهاز التجسيم إلى منصة الصدمة.
  3. بالنظر إلى الآثار المحتملة للتخدير على وقت منعكس تصحيح وشدة الإصابة بعد الإيقاع9،16 ، راقب عمق التخدير من خلال تقييم ردود الفعل المنسحبة والجفنية (الشكل 2F).
  4. قم بتوصيل قفل Luer الأنثوي ، الذي تم لصقه على نافذة الجمجمة الرقيقة ، بقفل Luer الذكري في نهاية أنبوب جهاز FPI (الشكل 2G).
    ملاحظة: في نمذجة rmTBI ، تم إطالة التخدير الناجم عن الإيزوفلوران في الفئران بسبب تحريض انقطاع النفس وفقدان الوعي عن طريق الإيقاع.
  5. قدم اثنين من إصابات الدماغ الرضية الخفيفة (فاصل 48 ساعة) مع الجهاز المعدل. قم بتطبيق تأثير FPI الأول مباشرة بعد الانتهاء من جراحة نافذة الجمجمة الرقيقة وتثبيت Luer Lock. قم بإدارة تأثير FPI فقط بمجرد أن يظهر الماوس عودة منعكس الانسحاب إلى قرصة مخلب في كل مناسبة (الشكل 2H). يمكن أن يؤدي تطبيق تأثير FPI في الفئران المخدرة بشدة إلى انقطاع النفس والموت لفترة طويلة.
    1. لتطبيق تأثير FPI ، ارفع البندول إلى الدرجة المحددة على طول المنقلة على الجهاز وحرر البندول باستخدام برنامج التحكم13,15. يجب أن يحقق التأثير شدة قرع تبلغ 2.0 ± 0.1 ضغط جوي ، باتباع البروتوكولات المعمول بها المستخدمة في دراسات القوارض10،17،18. استبعاد من الاختبارات الإضافية إذا لم يسجل التأثير بين 1.9-2.1 ضغط جوي أو إذا حدث كسر في الجمجمة أثناء FPI.
    2. بالنسبة للفئران الوهمية ، قم بتثبيتها على الجهاز ، لكن لا تحقق التأثير.
  6. بعد الاصطدام ، افصل اتصال Luer Lock على الفور ، وانقل الفئران إلى وسادة تسخين متساوية الحرارة للتعافي. بعد أن يستعيد الفأر اليقظة والوعي ، أعده إلى قفصه المنزلي دون إزالة قفل Luer الأنثوي. إدارة تأثير FPI الثاني ، بنفس الطريقة ، بعد 48 ساعة.
  7. بعد rmTBI ، قم بإزالة قفل Luer الأنثوي والأسمنت السني بعناية. خياطة فروة الرأس باستخدام لاصق الأنسجة واستخدام ملقط مسطح لقرص فروة الرأس لتسهيل عملية اللصق (انظر جدول المواد; الشكل 2I).
  8. لمنع الالتهاب والعدوى وتخفيف الألم وعدم الراحة بعد الجراحة ، ضع مزيجا من الإريثروميسين ومرهم ديكلوفيناك الصوديوم بنسبة 1: 1 (انظر جدول المواد) على الجرح. نقل الفئران إلى وسادة التدفئة متساوي الحرارة للتعافي.
  9. سجل مدة منعكس التصحيح ، والذي يبدأ عند إزالة الماوس من الجهاز التجسيمي ووضعه بشكل جانبي على منصة التصادم ل FPI ويستمر حتى يتمكن الماوس من الوقوف في وضع مستقيم بشكل مستقل.
  10. بعد أن يستعيد الفأر اليقظة والوعي ، أعده إلى قفصه المنزلي. عادة ما تكون الفئران واعية تماما وقادرة على المشي في غضون 1.5 ساعة بعد الإصابة.
  11. في الأيام التالية لنمذجة إصابات الدماغ الرضية ، راقب الفئران بحثا عن علامات مختلفة بما في ذلك أنماط التنفس ، ووجود مخاط حول الأنف والفم ، واحمرار أو تورم أو إفرازات أو إعادة فتح منطقة الجرح. استبعاد من الدراسة مع واحد أو أكثر من الأعراض غير الطبيعية المذكورة أعلاه.
    ملاحظة: يسمح الحقن المجهري المسبق ل AAV-GCaMP6s بمراقبة التوازن العصبي الأساسي Ca2 + والإثارة في القشرة المصابة من خلال نافذة الجمجمة الرقيقة باستخدام المجهر الماسح بالليزر ثنائي الفوتون15.

5. اختبار متاهة موريس المائية (MWM)

ملاحظة: MWM (انظر جدول المواد) هي طريقة معترف بها على نطاق واسع لتقييم التعلم المكاني وعجز الذاكرة في الفئران بعد إصابات الدماغ الرضية.

  1. قم بإجراء اختبار MWM بدءا من 7 أيام بعد الإصابة (DPI). يبلغ قطر المسبح الدائري ل MWM 120 سم وارتفاعه 50 سم ، مع الحفاظ على درجة حرارة الماء عند 25 درجة مئوية. افصل البركة الدائرية إلى أربعة أرباع ، مع منصة الهروب ، وهي منصة مستديرة يبلغ قطرها 6 سم وارتفاعها 30 سم ، مغمورة 1 سم تحت سطح الماء في الربع الشمالي الشرقي.
  2. ضع كاميرا مباشرة فوق المسبح الدائري لتسجيل مسار حركة الفئران. ضع علامة على الفئران بشريط أسود على ظهورها لتسهيل التعرف عليها بواسطة برنامج الحصول على الصور ولتسجيل البيانات ، بما في ذلك زمن الوصول ومسافة السباحة ومسار الحركة.
  3. ضع الفئران في الماء ، في مواجهة الجدار الداخلي لكل من الأرباع الأربعة ، مرة واحدة لكل ربع. بمجرد أن تجد الفئران المنصة ، اسمح لها بالراحة هناك لمدة 10 ثوان. إذا فشل الماوس في العثور على النظام الأساسي في غضون 60 ثانية ، فاطلب من المشغل توجيه الماوس إلى النظام الأساسي ، واتركه يستريح على المنصة لمدة 10 ثوان ، ثم أعد الماوس إلى قفصه المنزلي للراحة.
  4. كرر لكل ماوس تجربة الاستحواذ 4x يوميا. بعد تجارب الاستحواذ ، في 12 نقطة في البوصة ، قم بإجراء تجربة مسبار مكاني لمدة 60 ثانية وسجل عدد المرات التي عبرت فيها الفئران منطقة المنصة الأصلية ومدة بقاء الماوس في الربع حيث توجد المنصة.
  5. بعد كل تجربة ، جفف الفئران بسرعة بمنشفة أو ضعها تحت مصباح تدفئة للحفاظ على درجة حرارة أجسامها ومنع انخفاض حرارة الجسم أثناء تجربة الاستحواذ لمدة 60 ثانية من DPI 7 إلى DPI 11.
  6. بعد الانتهاء من الإجراءات التجريبية الموضحة أعلاه ، قم بتخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال (45 مجم / كجم ، أي p.) عند 13 نقطة في البوصة. محلول ملحي متساوي التوتر Perfuse transcardially ، يليه التروية مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (درجة الحموضة 7.2). استرجع أدمغة تلطيخ اعتلال الدماغ الكبدي التقليدي لتقييم التغيرات الجسيمة في مورفولوجيا القشرية والحصين. يمكن العثور على وصف مفصل لبروتوكول تلطيخ HE في المنشورات السابقة13،15.
  7. بعد الانتهاء من جميع التجارب ، القتل الرحيم للفأر عن طريق حقن جرعة زائدة من بنتوباربيتال (≥100 مجم / كجم ، i.p.) إذا لم تكن هناك حاجة إلى عينات فئران. قبل حصاد الأنسجة أو التخلص من الذبيحة ، راقب الماوس حتى لا يكون هناك نبضات قلب لمدة 60 ثانية على الأقل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يحدد البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة طريقة لتحفيز rmTBI من خلال نافذة الجمجمة الرقيقة ، والتي تقدم حلا لإصابة الدماغ الناتجة عن تحضير حج القحف أثناء نمذجة TBI الإيقاعية التقليدية. من خلال استخدام إجراء قرع السوائل المعدل هذا مع الجهاز المعدل ، تم تحقيق دقة محسنة وقابلية استنساخ تأثير FPI

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يشير TBI إلى نوعين أساسيين ، مغلق ومخترق ، حيث يتميز الأخير باضطراب في الجمجمة والأم الجافية. تشير البيانات السريرية إلى أن CHIs أكثر انتشارا من الإصابات المخترقة 1,2. بعد إصابات الدماغ الرضية الخفيفة ، يعاني معظم المرضى من أعراض متلازمة ما بعد الارتجاج التي عاد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة التنمية الاجتماعية الرئيسية لبلدية جينهوا (رقم 2020-3-071) ، وبرنامج التدريب على الابتكار وريادة الأعمال لطلاب كلية تشجيانغ (رقم: S202310345087 ، S202310345088) ومشروع خطة نشاط الابتكار العلمي والتكنولوجي لطلاب كلية مقاطعة تشجيانغ (2023R404044). يشكر المؤلفون الآنسة إيما أويانغ (طالبة في السنة الأولى بجامعة جونز هوبكنز ، بكالوريوس العلوم ، بالتيمور ، الولايات المتحدة الأمريكية) على تحرير المقالة لغوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
75% ethanol Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd. 220502
Buprenorphine hydrochlorideTianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., LtdH12020272Solution, Analgesic
CarprofenShanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd53716-49-7Powder, Analgesic
Chlorhexidine digluconateShanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.18472-51-019%-21% aqueous solution, Antimicrobial
Dental cement and solvent kitShanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.20220405, 3#Powder reconsituted in matching solvent
Dissecting microscopeShenzhen RWD Life Science Inc.77019
Erythromycin ointment Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.220412Antibiotic
Fiber Optic Cold Light SourceShenzhen RWD Life Science Inc.F-150C
Flat-tipped micro-drill bit Shenzhen RWD Life Science Inc.HM310082 mm, steel
FPI device softwareJiaxing Bocom Biotech Inc.Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR miceJinhua Laboratory Animal Center  Stock#202309125 Male mice, 25-30g, 8 weeks old
IsofluraneShandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd. 2023090501
Isothermal heating pad Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd. 
Luer Loc hupCustom made using a 19G needle hub
Micro hand-held skull drillShenzhen RWD Life Science Inc.78001Max: 38,000rpm
Modified FPI deviceJiaxing Bocom Biotech Inc.
Morris water mazeShenzhen RWD Life Science Inc.63031Evaluate mouse spatial learning and memory abilities
Open fieldShenzhen RWD Life Science Inc.63008Evaluate mouse locomoation and anxiety
Ophthalmic lubricant Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd. SC230724B
Sodium diclofenac ointment Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co.,Ltd.221207nonsteroidal anti-inflammatory drug
Small animal anesthesia system-Enhanced Shenzhen RWD Life Science Inc.R530IP
Smart video-tracking systemPanlab Harvard Apparatus Inc., MA, USAV3.0Animal tracking and analysis
Stereotactic frame Shenzhen RWD Life Science Inc.68043
Vetbond Tissue Adhesive3M, St Paul, MN, USA202402AXSuture the animal wound
Y mazeShenzhen RWD Life Science Inc.63005Evaluate mouse spatial working memory

References

  1. Jiang, J. Y., et al. Traumatic brain injury in china. Lancet Neurol. 18 (3), 286-295 (2019).
  2. Naumenko, Y., Yuryshinetz, I., Zabenko, Y., Pivneva, T. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 9 (7), e18342(2023).
  3. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660(2023).
  4. Grant, D. A., et al. Repeat mild traumatic brain injury in adolescent rats increases subsequent β-amyloid pathogenesis. J Neurotrauma. 35 (1), 94-104 (2018).
  5. Clark, A. L., et al. Repetitive mtbi is associated with age-related reductions in cerebral blood flow but not cortical thickness. J Cereb Blood Flow Metab. 41 (2), 431-444 (2021).
  6. Mcallister, T., Mccrea, M. Long-term cognitive and neuropsychiatric consequences of repetitive concussion and head-impact exposure. J Athl Train. 52 (3), 309-317 (2017).
  7. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nat Rev Neurosci. 14 (2), 128-142 (2013).
  8. Pham, L., et al. proteomic alterations following repeated mild traumatic brain injury: Novel insights using a clinically relevant rat model. Neurobiol Dis. 148, 105151(2021).
  9. Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated mild traumatic brain injury: Potential mechanisms of damage. Cell Transplant. 26 (7), 1131-1155 (2017).
  10. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  11. Freeman-Jones, E., Miller, W. H., Work, L. M., Fullerton, J. L. Polypathologies and animal models of traumatic brain injury. Brain Sci. 13 (12), 1709(2023).
  12. Petersen, A., Soderstrom, M., Saha, B., Sharma, P. Animal models of traumatic brain injury: A review of pathophysiology to biomarkers and treatments. Exp Brain Res. 239 (10), 2939-2950 (2021).
  13. Ouyang, W., et al. Modified device for fluid percussion injury in rodents. J Neurosci Res. 96 (8), 1412-1429 (2018).
  14. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).
  15. Liu, Y., Fan, Z., Wang, J., Dong, X., Ouyang, W. Modified mouse model of repeated mild traumatic brain injury through a thinned-skull window and fluid percussion. J Neurosci Res. 101 (10), 1633-1650 (2023).
  16. Bolton-Hall, A. N., Hubbard, W. B., Saatman, K. E. Experimental designs for repeated mild traumatic brain injury: Challenges and considerations. J Neurotrauma. 36 (8), 1203-1221 (2019).
  17. Aleem, M., Goswami, N., Kumar, M., Manda, K. Low-pressure fluid percussion minimally adds to the sham craniectomy-induced neurobehavioral changes: Implication for experimental traumatic brain injury model. Exp Neurol. 329, 113290(2020).
  18. Katz, P. S., Molina, P. E. A lateral fluid percussion injury model for studying traumatic brain injury in rats. Methods Mol Biol. 1717, 27-36 (2018).
  19. Xiong, B., et al. Precise cerebral vascular atlas in stereotaxic coordinates of whole mouse brain. Front Neuroanat. 11, 128(2017).
  20. Hoogenboom, W. S., et al. Evolving brain and behaviour changes in rats following repetitive subconcussive head impacts. Brain Commun. 5 (6), 316(2023).
  21. Lipton, M. L., et al. Soccer heading is associated with white matter microstructural and cognitive abnormalities. Radiology. 268 (3), 850-857 (2013).
  22. Rubin, T. G., et al. Mri-defined white matter microstructural alteration associated with soccer heading is more extensive in women than men. Radiology. 289 (2), 478-486 (2018).
  23. Mcinnes, K., Friesen, C. L., Mackenzie, D. E., Westwood, D. A., Boe, S. G. Mild traumatic brain injury (mtbi) and chronic cognitive impairment: A scoping review. PLoS One. 12 (4), e0174847(2017).
  24. Marschner, L., et al. Single mild traumatic brain injury results in transiently impaired spatial long-term memory and altered search strategies. Behav Brain Res. 365, 222-230 (2019).
  25. Hoogenboom, W. S., Branch, C. A., Lipton, M. L. Animal models of closed-skull, repetitive mild traumatic brain injury. Pharmacol Ther. 198, 109-122 (2019).
  26. Cunningham, J., Broglio, S. P., O'grady, M., Wilson, F. History of sport-related concussion and long-term clinical cognitive health outcomes in retired athletes: A systematic review. J Athl Train. 55 (2), 132-158 (2020).
  27. Fidan, E., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in the developing brain: Effects on long-term functional outcome and neuropathology. J Neurotrauma. 33 (7), 641-651 (2016).
  28. Nguyen, T., et al. Repeated closed-head mild traumatic brain injury-induced inflammation is associated with nociceptive sensitization. J Neuroinflammation. 20 (1), 196(2023).
  29. Ren, H., et al. Enriched endogenous omega-3 fatty acids in mice ameliorate parenchymal cell death after traumatic brain injury. Mol Neurobiol. 54 (5), 3317-3326 (2017).
  30. Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. J Bone Miner Res. 31 (2), 299-307 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion
Posted by JoVE Editors on 6/04/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66440

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CHI FPI RmTBI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved