محرك TD: غرسة بارامترية مفتوحة المصدر للتسجيلات الكهربية متعددة المناطق في الفئران الناقلة والنائمة

Summary

هنا ، نقدم غرسة فريدة من نوعها قابلة للطباعة 3D للفئران ، تسمى TD Drive ، قادرة على تسجيلات قطب سلكي ثنائية متناظرة ، حاليا في ما يصل إلى عشر مناطق دماغية موزعة في وقت واحد.

Abstract

تكمن التفاعلات المعقدة بين مناطق الدماغ المتعددة وراء معظم الوظائف المنسوبة إلى الدماغ. عملية التعلم ، وكذلك تكوين وتوحيد الذكريات ، هما مثالان يعتمدان بشكل كبير على الاتصال الوظيفي عبر الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التحقيق في أوجه التشابه و / أو الاختلاف في نصف الكرة الغربي يسير جنبا إلى جنب مع هذه التفاعلات متعددة المناطق. وبالتالي ، تعتمد الدراسات الفيزيولوجية الكهربية التي تحاول توضيح هذه العمليات المعقدة على تسجيل نشاط الدماغ في مواقع متعددة في وقت واحد وغالبا بطريقة ثنائية. يظهر هنا غرسة 3D قابلة للطباعة للفئران ، تسمى TD Drive ، قادرة على تسجيلات قطب سلكي ثنائية متناظرة ، حاليا في ما يصل إلى عشر مناطق دماغية موزعة في وقت واحد. تم إنشاء التصميم مفتوح المصدر باستخدام مبادئ التصميم البارامتري ، مما يسمح للمستخدمين المحتملين بتكييف تصميم محرك الأقراص بسهولة مع احتياجاتهم ببساطة عن طريق ضبط المعلمات عالية المستوى ، مثل الإحداثيات الأمامية والخلفية والمتوسطة لمواقع قطب التسجيل. تم التحقق من صحة تصميم الزرع في n = 20 فئران Lister Hooded التي أدت مهام مختلفة. كانت الغرسة متوافقة مع تسجيلات النوم المربوطة وتسجيلات المجال المفتوح (استكشاف الكائنات) بالإضافة إلى التسجيل اللاسلكي في متاهة كبيرة باستخدام نظامين مختلفين للتسجيل التجاري ومراحل الرأس. وبالتالي ، يظهر هنا التصميم والتجميع القابل للتكيف لزرع فيزيولوجي كهربي جديد ، مما يسهل التحضير والزرع السريع.

Introduction

إن الطبيعة متعددة المناطق لتفاعلات الدماغ أثناء الاستيقاظ والنوم تجعل من الصعب إجراء دراسة شاملة للعمليات الفسيولوجية الجارية. في حين أن الأساليب مثل التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (fMRI) والموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) تسمح بأخذ عينات من نشاط الدماغ من الدماغ^{الكامل 1,2} ، فإنها تستغل اقتران الأوعية الدموية العصبية لاستنتاج نشاط الدماغ من نشاط الدورة الدموية ، مما يحد من دقتها الزمنية². بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي وضع موضوع البحث في ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يحظر التجارب مع التي تتحرك بحرية. يتيح التصوير البصري لديناميكيات الكالسيوم باستخدام التصوير الفردي أو متعدد الفوتونات تسجيلات خاصة بنوع الخلية لمئات الخلايا العصبية في وقت واحد³. ومع ذلك ، فإن المجاهر المثبتة على الرأس مثل Miniscope³ ، والتي تسمح بسلوك الحركة بحرية ، عادة ما تقتصر على تصوير المناطق القشرية السطحية في الأدمغة^{السليمة 4}. في حين أن قطر مجال رؤيتها على القشرة يمكن أن يكون في حدود 1 مم ، فإن متطلبات المساحة لهذه المجاهر المثبتة على الرأس يمكن أن تجعل من الصعب استهداف عدة مناطق ، خاصة المجاورة. لذلك ، لالتقاط ديناميكيات الدماغ متعددة المناطق في الاستيقاظ والنوم بدقة ، تعد الفيزيولوجيا الكهربية خارج الخلية ، المسجلة بأقطاب كهربائية مزروعة في مناطق اهتمام الدماغ ، إحدى الطرق المفضلة نظرا لدقتها الزمنية العالية ودقتها المكانية⁵. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بتوصيف ديناميكيات النوم في المتوافقة مع التحليلات التي تم الحصول عليها من EEG البشري ، مما يزيد من القيمة الانتقالية لهذه الطريقة⁶.

كلاسيكيا ، استخدمت الدراسات التي تسجل نشاط الدماغ باستخدام أقطاب كهربائية خارج الخلية أقطاب سلكية فردية أو حزم أقطاب كهربائية ، مثل tetrodes⁷. تسمح المجسات الحديثة مثل مسبار Neuropixels⁸ باستهداف عدة مناطق في وقت واحد ، نظرا لأنها محاذاة على محور يسمح بزرع المسبار على طول هذا المحور دون إضعاف. ومع ذلك، لا تزال التسجيلات المتزامنة الدقيقة للمناطق المتعددة المنفصلة مكانيا تمثل تحديا، حيث تكون الطرق الحالية إما مكلفة أو تستغرق وقتا طويلا.

في السنوات الأخيرة ، أصبحت طرق التصنيع المضافة مثل الطباعة الحجرية المجسمة متاحة على نطاق واسع. سمح ذلك للباحثين بتطوير غرسات أقطاب كهربائية جديدة قابلة للتكيف مع متطلباتهم التجريبية⁹ ، على سبيل المثال ، الاستهداف المبسط القابل للتكرار لمناطق متعددة من الدماغ. في كثير من الأحيان ، تتم مشاركة تصميمات الغرسات هذه أيضا مع المجتمع الأكاديمي كأجهزة مفتوحة المصدر ، مما يسمح للباحثين الآخرين بتكييفها مع أغراضهم الخاصة. تختلف درجة القدرة على التكيف لغرسات معينة نتيجة لكيفية تصميم الغرسة وكيفية مشاركتها. النمذجة البارامترية¹⁰ هي نهج شائع في التصميم بمساعدة الكمبيوتر ، حيث ترتبط المكونات المختلفة للتصميم بمعلمات مترابطة وتاريخ تصميم محدد. يؤدي تنفيذ نهج حدودي لتصميم الغرسات إلى زيادة قابليتها لإعادة الاستخدام والقدرة على التكيف¹⁰ ، حيث يقوم تغيير المعلمات الفردية تلقائيا بتحديث التصميمات الكاملة دون الحاجة إلى إعادة نمذجة معقدة للتصميم. الضرورة التبعية هي أن التصميم نفسه يتم مشاركته بتنسيق قابل للتحرير يحافظ على العلاقات البارامترية وتاريخ التصميم. تنسيقات الملفات التي تمثل الأوليات الهندسية فقط ، مثل STL أو STEP ، تجعل التعديلات البارامترية اللاحقة للنماذج المنشورة غير ممكنة.

في حين أن محركات الأقراص الفائقة رباعية^11،12،13 تمكن التسجيلات من عشرات tetrodes ، فإن تجميعها وزرعها يستغرق وقتا طويلا ، وتعتمد جودتها إلى حد كبير على مهارة وخبرة الباحث الفردي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها عادة ما تجمع بين أنابيب التوجيه التي توجه أقطاب التسجيل إلى موقعها المستهدف في حزمة واحدة أو حزمتين أكبر ، مما يحد من عدد وانتشار المناطق التي يمكن استهدافها بكفاءة.

غرسات أخرى^14,15 تكشف الجمجمة الكاملة وتسمح بوضع العديد من محركات الأقراص الصغيرة الفردية التي تحمل أقطاب التسجيل مجانا. في حين أن وضع محركات الأقراص الصغيرة^{المستقلة 16} أثناء وقت الجراحة يزيد من المرونة ، إلا أنه يزيد من وقت الجراحة ويمكن أن يجعل من الصعب استهداف مناطق متجاورة متعددة بسبب متطلبات المساحة لمحركات الأقراص الصغيرة الفردية. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن الغرسات مفتوحة المصدر ، إلا أنها تنشر فقط كملفات STL ، مما يجعل التعديل صعبا.

مثال على محرك ذو فلسفة بارامترية أكثر متأصلة هو RatHat¹⁷. من خلال توفير استنسل جراحي يغطي السطح الظهري الكامل للجمجمة ، فإنه يسمح بالاستهداف الدقيق لأهداف الدماغ المتعددة دون استخدام إطار تجسيمي أثناء الجراحة. تتوفر أشكال زرع متعددة للقنية أو البصريات أو رباعيات القنوات. ومع ذلك ، في حين أن محرك الأقراص مجاني للاستخدام للأغراض الأكاديمية ، إلا أنه لا يتم نشره مفتوح المصدر ، مما يخلق عقبة أمام الباحثين لتقييم واستخدام الغرسة.

يظهر في هذه المقالة محرك TD (انظر الشكل 1) ، وهو غرسة جديدة قابلة للطباعة ثلاثية الأبعاد لتسجيلات القطب خارج الخلية في الفئران. يهدف TD Drive إلى التغلب على بعض عيوب الحلول الحالية: فهو يسمح باستهداف مناطق متعددة من الدماغ ، معكوسة عبر نصفي الكرة الأرضية ، باستخدام أقطاب سلكية مستقلة في وقت واحد. نظرا لتصميمه البسيط ، يمكن تجميعه في غضون ساعات قليلة بتكلفة منخفضة نسبيا من قبل باحثين أقل خبرة. يتم نشر TD Drive مفتوح المصدر ، بتنسيقات ملفات قابلة للتعديل بسهولة للسماح للباحثين بتعديله وفقا لاحتياجاتهم الخاصة. يسمح دمج نهج النمذجة 3D البارامترية من بداية عملية تصميم TD Drive بتجريد المعلمات اللازمة للتغيير: لتغيير المواقع المستهدفة ، يمكن للباحثين ببساطة تحرير المعلمات التي تمثل إحداثياتها الظهرية البطنية والأمامية الخلفية ، دون الحاجة إلى إعادة تصميم محرك الأقراص بأنفسهم. يمكن العثور على الملفات لتعديل وتصنيع محرك TD في https://github.com/3Dneuro/TD_Drive.

الشكل 1: نظرة عامة على محرك TD. (أ) عرض محرك TD بغطاء واقي. (ب) العرض مع الأجزاء الداخلية الموضحة. يتميز محرك TD ب (أ) مواقع تسجيل متعددة وقابلة للتعديل بارامتريا لأسلاك الأقطاب الكهربائية الثابتة والمتحركة ، و EIB مع (ب) موصل Omnetics عالي الكثافة متوافق مع أنظمة الحصول على البيانات المربوطة واللاسلكية الشائعة ، و (ج) تعيين قناة بديهية محسنة للتسجيلات باستخدام أنظمة Intan / Open Ephys (انظر الشكل التكميلي 1) و (د) غطاء لحماية الغرسة أثناء التسجيلات المربوطة وعندما لا يتم توصيل مرحلة الرأس. (ج) يسهل استنسل التوجيه الموجود في الجزء السفلي من محرك TD وضع قنيات التوجيه ويعمل كتحقق زائد عن الحاجة لمواقع الزرع أثناء الجراحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تجريب تصميم الغرسة في n = 4 ، وتم التحقق من صحته في n = 8 ، وتم تأكيده في n = 8 فئران Lister Hooded التي أدت مهام مختلفة. تم استخدام أول 4 لتطوير محرك الأقراص وضبط المعلمات. بعد ذلك ، تم تشغيل طيار كامل مع 8 (كما هو موضح في النتائج). تم تشغيل مجموعة ثانية من 8 وإدراجها في تحليل بقاء الزرع. كانت الغرسة متوافقة مع تسجيلات النوم المربوطة وتسجيلات المجال المفتوح (استكشاف الكائنات) بالإضافة إلى التسجيل اللاسلكي في متاهة كبيرة (HexMaze 9 م × 5 م) باستخدام نظامين مختلفين للتسجيل التجاري ومراحل الرأس. تم تسجيل الفوجين من 8 مع نظامين مختلفين للاستحواذ - مربوط لتسجيلات نوم أطول ولاسلكي لتسجيلات استكشاف المتاهة الكبيرة. يمكننا أن نستنتج أن هذا المحرك السلكي البسيط يسمح بإجراء تجارب طويلة الأمد مع مجموعات أكبر من قبل باحثين أقل خبرة لتمكين تحليل مرحلة النوم وكذلك تحليل التذبذب في مناطق متعددة من الدماغ. هذا على عكس معظم غرسات الفيزيولوجيا الكهربية حتى الآن ، والتي ، بسبب الصعوبة وكثافة الوقت ، تسمح بمجموعات حيوانية أصغر وعادة ما تحتاج إلى مجربين ذوي خبرة كبيرة. ومع ذلك ، مع هذا المحرك ، لا يمكن تسجيل أي نشاط عصبي فردي. وبالتالي ، يقتصر الاستخدام على التحقيقات في إمكانات المجال المحلي (LFP) ونشاط الجمع.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة المركزية الهولندية Dierproeven (CCD) وأجريت وفقا لقانون التجارب على (رموز البروتوكول: 2020-0020-006 و 2020-0020-010). تم استخدام ذكور الفئران Lister المقنعين من 9-12 أسبوعا عند الوصول. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في البروتوكول في جدول المواد. انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2 لمعرفة خطوات عملية بناء محرك الأقراص.

1. ضبط وإنشاء نماذج 3D وبيانات لوحة واجهة القطب (EIB)

1. افتح تصميم جسم محرك الأقراص في Autodesk Fusion. انقر فوق تغيير المعلمات ضمن علامة التبويب تعديل . اضبط إحداثيات موقع التسجيل الأول عن طريق إدخال الإحداثي الأمامي الخلفي في الموقع الأمامي الخلفي1 والإحداثي المتوسط الجانبي في الموقع المتوسط1. يمكن للمرء ضبط قطر الفتحة لأنبوب التوجيه أو الأقطاب الكهربائية عن طريق ضبط القطرSite1. كرر ذلك لتسجيل المواقع 2 و 3 ، وسيتم ضبط تصميم النموذج تلقائيا.
   ملاحظة: المواقع الثلاثة المستخدمة للبروتوكول الحالي هي الحصين (HPC) ، الذي يحتوي على حزم سلكية متحركة ، وقشرة الفص الجبهي (PFC) وخلف الطحال (RSC) ، وكلاهما مع حزم سلكية ثابتة (تستهدف حزمة سلك PFC كلا من القشرة الحزامية الأمامية (PRL) والحزامية الأمامية (ACC). يقدم الجدول 1 الحدود المفروضة يدويا على المعلمات التي تتحكم في الإحداثيات المتوسطة لمواقع التسجيل.
2. قم بتصدير جسم محرك الأقراص المحدث بالنقر بزر الماوس الأيمن فوقه في المتصفح وتحديد حفظ كشبكة. حدد نوع STL (ثنائي) ، وحدات مم ، وصقل عالية.
3. اختر إما ملفات STL المعدة للغطاء العادي أو ، إذا لزم الأمر (على سبيل المثال ، عندما تكون الأهداف جانبية جدا) ، ملفات STL المعدة للأحرف الكبيرة الكبيرة.
4. اعتمادا على الحد الأقصى الذي يختاره المرء ، حدد إما بنك الاستثمار الأوروبي العادي أو الكبير للإنتاج. يتم توفير ملفات إنتاج Gerber لكل من EIBs كأرشيفات مضغوطة يمكن إرسالها مباشرة إلى خدمة التصنيع.

2. طباعة نماذج 3D وتصنيع بنك الاستثمار الأوروبي

ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم استخدام طابعة 3D متاحة تجاريا لإنتاج الأجزاء (انظر جدول المواد). عند استخدام طابعات مختلفة أو الاستعانة بمصادر خارجية للإنتاج ، قد يلزم استخدام راتنجات مختلفة وقابلة للمقارنة لإنتاج الأجزاء.

1. اطبع جسم محرك الأقراص والمكوكات باستخدام الطباعة الحجرية المجسمة⁹ بدقة عالية في راتينج عادي أو متوافق حيويا (على سبيل المثال ، راتينج شفاف أو أسود أو أبيض) بارتفاع طبقة 25 ميكرومتر. اطبع أجزاء الغطاء براتينج قوي ومتين (على سبيل المثال ، Tough 2000).
2. إما تصنيع بنك الاستثمار الأوروبي داخليا أو إنتاجه من قبل مزود خدمة خارجي. قم بلحام الموصل عالي الكثافة ببنك الاستثمار الأوروبي باستخدام تقنيات اللحام SMD (الجهاز المثبت على السطح).
   ملاحظة: عندما لا تكون من ذوي الخبرة في لحام المكونات الإلكترونية الدقيقة ، فمن المستحسن أن يتم اللحام خارجيا ، على سبيل المثال ، في ورشة الإلكترونيات بالجامعة أو مورد تجاري. عزز الموصل الملحوم عالي الكثافة عن طريق تطبيق إيبوكسي قوي حول الموصل. احرص على عدم تغطية ثقوب الأقطاب الكهربائية بالإيبوكسي.

3. مرحلة ما بعد المعالجة للجسم المطبوع ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: يجب ألا يحتاج الغطاء والمكوكات إلى معالجة لاحقة. اعتمادا على جودة مطبوعات 3D ، قد تحتاج إلى أن تكون غطى بالرمل قليلا أو إزالة آثار الدعم المتبقية. عند الصنفرة والحفر ، احرص على عدم كسر جدران جسم محرك الأقراص. إذا لزم الأمر ، قم بتنظيف الأجزاء المعالجة بعد المعالجة باستخدام الأيزوبروبانول و / أو قطعة قماش ناعمة و / أو هواء مضغوط.

1. قم بحفر فتحات أنابيب التوجيه في الجزء العلوي والسفلي من جسم محرك الأقراص باستخدام مثقاب 0.5 مم مثبت في ملزمة دبوس. هذا يضمن أن الأبعاد صحيحة ومتسقة عبر المواقع.
2. قم بحفر فتحتي الحوض (كما في الشكل 2E) على جسم محرك الأقراص لإدخال نحاسي المكوك باستخدام مثقاب 2 مم في ملزمة دبوس.
3. قم بتنظيف فتحات الحوض من حطام الحفر بالهواء المضغوط. ثم اضغط على فتحات التوجيه لمسامير المكوك ، والتي هي امتداد لفتحات الحوض ، بنقرة M1. قم بإجراء التنصت في تكرارين أو أكثر ، وتنظيف الحطام من الصنبور والثقب بين التكرارات. اختياريا تليين الصنبور مع قطرة من الزيت المعدني.
4. نظف جسم محرك الأقراص من الثقب والتنصت على الحطام بالهواء المضغوط.

الشكل 2: عرض محرك TD. (أ ، ب) محرك TD (أ) بدون و (ب) مع غطاء واقي على نموذج جمجمة الفئران. (ج) أنابيب توجيه بوليميد تدخل بشكل صحيح في كل موقع من مواقع التسجيل الستة. (د) مجموعة مكوك معزولة ومكتملة تتميز ببرغي التوجيه ، ومكوك مطبوع 3D ، وإدراج نحاسي ملحوم. (E) جسم محرك TD مع إدخال مكوكين. تم تمييزها باللون الأحمر: (أ) فتحات مغسلة للمكوك ، (ب) دليل المكوك ، (ج) الركائز المركزية لجسم محرك الأقراص ، (د) استنسل التوجيه. (و ، ز) تتم الإشارة إلى المواقع المهمة في الجزء العلوي (F) والسفلي (G) من جسم محرك الأقراص والتي قد تتطلب معالجة لاحقة بعد الطباعة ثلاثية الأبعاد بسهم أحمر لكل منها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تجميعات المكوك

1. حرك مكوكا مطبوعا ثلاثي الأبعاد على برغي M1x16. استخدم ملحقا نحاسيا M1 لتثبيت المكوك المطبوع 3D في مكانه. يجب أن يكون المكوك قادرا على الدوران بحرية دون التحرك لأعلى أو لأسفل بعد وضع الملحق.
   تنبيه: تحتوي الخطوات التالية على مخاطر الحرق (اللحام). اعتمادا على تدفق اللحام واللحام المستخدم ، قد تشمل التعرض لمهيجات الجهاز التنفسي والرصاص. احرص دائما على ارتداء واقي العين عند اللحام (حيث يمكن أن يتعثر اللحام) واتبع الإرشادات المناسبة للتعامل الآمن مع المواد التي يحتمل أن تكون ضارة ، بما في ذلك التهوية المناسبة لمساحة العمل لاستخراج أبخرة اللحام. اتبع اللوائح المحلية وإجراءات التشغيل أو استشر المواد المتاحة عبر الإنترنت^18,19.
2. باستخدام كمية صغيرة من معجون اللحام ، قم بلحام الإدخال النحاسي في المسمار. احرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الملحق والمسمار حتى لا تذوب المكوك المطبوع 3D. اعتمادا على الراتنج المستخدم في طباعة المكوك 3D ، يصعب تجنب كمية صغيرة من الذوبان (وبالتالي ، المكوك الذي يلتصق بالإدخال).
   ملاحظة: عند استخدام مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ ، قد تكون هناك حاجة إلى تدفق اللحام. يوصى باستخدام مسامير نحاسية أو آلية فولاذية ، لأنها أسهل في اللحام.
3. بعد تبريد مجموعة المكوك ، قم بتدوير المكوك المطبوع 3D برفق عدة مرات حول المسمار. إذا اندمج المكوك في الملحق أثناء اللحام ، فيجب أن يحرره.
   ملاحظة: تأكد من أن المكوك يمكن أن يدور بحرية وأنه لا يتمايل. إذا حدث ذلك ، فتخلص من مجموعة المكوك وابدأ مجموعة جديدة. حاول بعناية تدوير إدراج النحاس. إذا كان يدور فيما يتعلق بالمسمار ، كرر عملية اللحام.

5. تجميع محرك الأقراص

1. قطع أنابيب البوليميد المتاحة تجاريا إلى حوالي 25 مم في الطول ، ولكن على الأقل طويلة بما يكفي لتمتد عبر جسم محرك الأقراص الكامل.
2. أدخل أنابيب توجيه البوليميد في جسم محرك الأقراص. يجب إدخال كل أنبوب من خلال فتحة واحدة في الجزء العلوي من محرك الأقراص والفتحة المقابلة في استنسل التوجيه في الجزء السفلي من محرك الأقراص ("d" في الشكل 2E). يجب إدخال الأنابيب حتى تتدفق مع الجزء العلوي من جسم محرك الأقراص.
3. باستخدام إبرة رفيعة أو عود أسنان ، ضع كمية صغيرة من غراء cyanoacrylate السائل على الثقوب الموجودة أعلى جسم محرك الأقراص لتثبيت أنابيب التوجيه في مكانها. ضع الغراء من الجانب السفلي من الجسم لتجنب دخول الغراء إلى أنابيب التوجيه. سيتم سحب الغراء إلى الفراغ بين جسم محرك الأقراص وأنبوب التوجيه بواسطة قوى شعرية وبالتالي ربط الاثنين.
4. ضع كمية صغيرة من غراء cyanoacrylate على الواجهة بين أنابيب التوجيه واستنسل التوجيه في الجزء السفلي من جسم محرك الأقراص. مرة أخرى ، احرص على عدم انسداد أنابيب التوجيه بالغراء. دع الغراء يجف لبضع دقائق.
   ملاحظة: يعتمد مقدار الوقت اللازم بالضبط على مادة محرك الأقراص والخلوص بين جسم محرك الأقراص وأنابيب التوجيه. بشكل عام ، يجب أن تكون 5-10 دقائق كافية.
5. اقلب جسم محرك الأقراص رأسا على عقب واقطع أنابيب توجيه البوليميد في الأسفل بحيث تمتد حوالي 1 مم خارج الركائز المركزية لجسم محرك الأقراص ("c" في الشكل 2E والشكل التكميلي 2). في هذا التكوين ، ستكون نهاية أنابيب التوجيه متدفقة مع سطح الدماغ عند الزرع.
   ملاحظة: تم تطوير محرك الأقراص لاستهداف مناطق أعمق من الدماغ. إذا تم استهداف المناطق القشرية السطحية ، فقد تكون أنابيب توجيه بوليميد أقصر ضرورية حتى لا تجرح سطح الدماغ في حالة تورم الدماغ الأولي.
6. أدخل مجموعتين من مجموعات المكوك في جسم محرك الأقراص. أثناء شدها في فتحات التوجيه المستغلة ، تأكد من أن البراغي موازية لأدلة المكوك ("ب" في الشكل 2E). استخدم الأصابع لمحاذاة المكوكات برفق مع أدلة المكوك.
7. قم بربط المكوكات بالكامل في فتحات الحوض للتحقق من أن الإدخالات النحاسية لمجموعة المكوك لا تتعثر في جسم محرك الأقراص أو تصطدم بأنابيب توجيه البوليميد. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يلزم مسافة لا تقل عن 16 دورة كاملة. إذا لم يتم الوصول إلى ذلك ، فقم بقطع أنبوب البوليميد أعلى جسم محرك الأقراص بشكل أكبر لتوفير مساحة أكبر. لا تفرط في إحكام ربط المكوك في جسم محرك الأقراص - فقد يؤدي ذلك إلى تدمير الخيوط المحاصرة على جسم محرك الأقراص واتصال اللحام لمجموعة المكوك.
   ملاحظة: إذا علقت مجموعة المكوك ، فقم بإزالتها تماما وتحقق مما إذا كان اتصال اللحام قد تم فكه. في هذه الحالة ، استخدم مجموعة مكوك جديدة. إذا اصطدمت مجموعة المكوك بأنبوب توجيه ، فقم بتقصير أنبوب التوجيه بحيث لا يمتد إلى ما وراء جسم محرك الأقراص.
8. قم بربط بنك الاستثمار الأوروبي بجسم محرك الأقراص باستخدام مسامير البولي إيميد M2.5x5. ضع بضع قطرات من غراء cyanoacrylate بين جسم محرك الأقراص وبنك الاستثمار الأوروبي. تأكد من عدم انسداد الثقوب من خلال توصيل القطب.

6. تحضير الغطاء الواقي

1. أدخل صمولة M2 من الفولاذ المقاوم للصدأ في البثق الموجود على نصف الغطاء الأيسر وقم بإصلاحه بغراء cyanoacrylate.
2. إذا لزم الأمر ، قم بحفر الفتحة الموجودة في مقدمة الغطاء الأيسر باستخدام مثقاب M1 في ملزمة دبوس. اضغط على الفتحة الموجودة في مقدمة نصف الغطاء الأيمن بنقرة M1.

7. تحضير أقطاب الأسلاك

1. قم بإعداد لوحين معدنيين كسطح لإنشاء حزم أسلاك القطب الكهربائي. تعمل الألواح كسطح مسطح ومستقر ولكنه متحرك يحدث عليه تجميع حزمة الأسلاك واللصق والقطع. قم بتوصيل ورق رسم باللوحة الأولى وعقد شريطا لاصقا للرسامين على اللوحة الثانية ، مع توجيه السطح اللاصق لأعلى.
2. سيتم قطع ثلاثة من الأسلاك الأربعة في حزم HPC بزاوية 60 درجة لإنشاء إزاحة في الاتجاه الظهري البطني. سيسمح ذلك بوضع سلك فوق الطبقة الهرمية الحصين وداخلها وأسفلها ، على التوالي. لتسهيل القطع ، ارسم خطا واضحا بزاوية 60 درجة على ورق التخطيط (خط 60 درجة).
3. لكل حزمة قطب كهربائي HPC ، قم بقطع 4 قطع من سلك القطب بطول 4.5 سم لكل منها. لكل حزمة قطب كهربائي PFC و RSC ، قم بقطع 4 قطع من سلك القطب بطول 3.5 سم لكل منها.
4. التقط 4 أسلاك برفق عن طريق لمسها بطرف إصبع (سوف تلتصق بها) وضعها في أقرب مكان ممكن بجانب بعضها البعض على شريط الرسامين. تأكد من عدم وضعها فوق بعضها البعض.
5. تحت المجهر ، استخدم ملقط لوضع الأسلاك معا في أقرب وقت ممكن. ضع طبقة رقيقة من غراء cyanoacrylate السائل على أول 2 سم من الجزء العلوي من الحزمة. بالنسبة لحزمة HPC ، > الغراء 2 سم < 3.5 سم من السلك. انتظر حتى يجف الغراء.
6. المس الأسلاك برفق ببعض الملقط تحت المجهر. إذا لم ينفصلوا ، يتم لصقها بشكل صحيح. كفحص للعقل ، تأكد من أن طبقة الغراء تضيء تحت إضاءة المجهر.
7. بمجرد أن تجف تماما ، قم بإزالة حزمة الأسلاك من الشريط ونقلها إلى اللوحة باستخدام ورق التخطيط. تحت المجهر ، تحقق من حزمة الأسلاك بحثا عن الغراء الزائد في الأعلى أو على الجانبين ، وقم بإزالتها بعناية باستخدام شفرة مشرط.
8. بالنسبة لحزم RSC ، قم بعمل قطع مستقيم في الجزء السفلي من الصفيف ، عموديا على اتجاه الأسلاك.
9. بالنسبة لحزم HPC ، ضع المصفوفة على ورقة الرسم بحيث تتقاطع مع خط 60 درجة ، واستخدم الخط كدليل لعمل زاوية مقطوعة 60 درجة لاتجاه الأسلاك.
   1. بعد ذلك ، استخدم شفرة مشرط لتقسيم أقصر 4 أسلاك بعناية من الحزمة. اقطع السلك عموديا على اتجاه السلك ، وقم بتقصيره إلى 0.75 مم تقريبا مقارنة بثاني أطول سلك في الحزمة.
10. بالنسبة لحزم PFC ، قم بتقسيم الجزء السفلي من الصفيف إلى حزمتين 2 سلك. تأكد من لصق السلكين معا جيدا. قم بتقصير إحدى الحزم المكونة من سلكين بمقدار 1 مم عن طريق قصها بشكل عمودي على اتجاه السلك. انظر الشكل التكميلي 1 (أسفل) والشكل التكميلي 2 ب للحصول على صور لحزم الأسلاك المقطوعة.

8. تحضير الأسلاك الأرضية وأسلاك EEG

1. ادفع ما لا يقل عن 10 من سنون SIP/DIP من شريط مقبس SIP/DIP المتصل بمسافة 1.27 مم.
2. قطع 2 قطعة بطول 6 سم لسلك الأرض (GND). قطع 8 قطع بطول 6 سم لسلك EEG. استخدم شفرة مشرط لإزالة بعض العزل بعناية من طرفي جميع الأسلاك.
3. ضع برغيا من الفولاذ المقاوم للصدأ M1x3 في يد ثالثة ، مع ترك أكبر مساحة ممكنة يمكن الوصول إليها أسفل رأس المسمار. لف جانبا غير معزول من سلك GND أو EEG حول ساق المسمار ، أسفل رأس المسمار مباشرة.
4. ضع كمية صغيرة من تدفق اللحام بإبرة صغيرة أو مسواك. لحام السلك إلى المسمار. تأكد من عدم انسداد فتحة رأس المسمار عن طريق الخطأ.
5. ضع دبوس SIP / DIP في اليد الثالثة بحيث يمكن الوصول إلى الجانب الأنثوي. أدخل الجزء غير المعزول من الجانب الآخر من السلك في دبوس SIP / DIP. ضع كمية صغيرة من تدفق اللحام وقم بلحام السلك على الدبوس.
6. قم بإزالة مجموعة الأسلاك اللولبية الملحومة من الحامل. سيتم زرع هذه المجموعة في الجمجمة أثناء جراحة الزرع.
7. ضع دبوسا آخر SIP / DIP في الحامل ، يتم تدويره 180 درجة (أي يمكن الوصول إلى جانب الذكور). ضع كمية صغيرة من تدفق اللحام وقم بلحام جانب غير معزول من السلك الآخر على الجانب الذكري من الدبوس.
8. قم بإزالة مجموعة دبوس الأسلاك الملحومة من الحامل. سيتم توصيل هذا التجميع لاحقا ببنك الاستثمار الأوروبي ، وسيتم توصيل مجموعة الأسلاك اللولبية بالإضافة إلى مجموعة دبوس الأسلاك ببعضهما البعض أثناء جراحة الزرع باستخدام دبابيسهما.
9. لتعزيز الوصلات الملحومة ، ضع كمية صغيرة من غراء cyanoacrylate على الاتصال بين الأسلاك والدبابيس.
10. بعد أن يجف الغراء ، تحقق من إمكانية توصيل دبابيس SIP / DIP للتجميعين بسلاسة. استخدم خيار التحقق من استمرارية المتر المتعدد للتحقق من وجود اتصال مستمر بين المسمار ونهاية السلك غير المعزول لمجموعة دبوس السلك عند توصيل كلا التجميعات. اختياريا ، قم بترميز كل مجموعة من الأسلاك بطلاء الأظافر (انظر جدول المواد) لتبسيط الاتصال الصحيح أثناء جراحة الزرع.

9. تحميل حزم الأسلاك في محرك الأقراص

1. قم بتوصيل محرك الأقراص بحامل. احرص على عدم الضغط كثيرا على بنك الاستثمار الأوروبي أو إتلاف الموصل عالي الكثافة في هذه الخطوة.
2. بمجرد أن يصبح جسم محرك الأقراص في وضع مستقر ، خذ إحدى حزم الأسلاك وحركها بعناية في أنبوب البوليميد المعني ، إما باليد أو باستخدام زوج من الملقط الدقيق. تأكد من وضع صفيف الأسلاك في الاتجاه الصحيح (على سبيل المثال ، بالنسبة لصفيف PFC ، يجب أن يكون السلكان الأطول للصفيف متجهين وسطيا) ، واحرص على عدم ثني صفيف الأسلاك.
3. كرر الخطوة الأخيرة لجميع حزم الأسلاك الأخرى.
4. استخدم ملقط رفيعا للإمساك بأحد الأسلاك وثنيه بعناية نحو الفتحة التي يريد المرء إدخالها فيها. بمجرد إدخاله ، استخدم دبوسا ذهبيا لتثبيته في فتحة بنك الاستثمار الأوروبي. كرر هذا لجميع أسلاك الحزمة ولجميع الحزم.
   1. تأكد من أنه خلال هذه المرحلة ، تصنع الأسلاك حلقة لطيفة فوق بنك الاستثمار الأوروبي (بهذه الطريقة ، لا يزال هناك مجال لتحريك الحزمة لأعلى ولأسفل أنبوب البوليميد من أجل ضبط الطول في الجزء السفلي من الأنبوب) وأن المصفوفة التي تبرز من أسفل أنبوب البوليميد لا تنحني عن طريق الخطأ. تأكد من تدوين أي سلك من كل حزمة سلكية يتصل بكل قناة على بنك الاستثمار الأوروبي. انظر الشكل التكميلي 1 للحصول على تفاصيل حول رسم خرائط القنوات لمحرك TD.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، بعد تحميل كل حزمة سلكية (الخطوة 9.2) ، يمكن للمرء توصيل الأسلاك مباشرة ببنك الاستثمار الأوروبي (الخطوة 9.4) ثم المتابعة مع الخطوة 9.2 + 9.4 لحزم الأسلاك المتبقية. يمكن أن يختلف هذا بناء على التفضيلات الشخصية للمجربين. انظر الشكل التكميلي 2 ب للحصول على مثال لمحرك أقراص TD تم تحميله.
5. اضبط طول حزم الأسلاك لاستهداف مواقع التسجيل بشكل صحيح عن طريق دفع أو سحب حزم الأسلاك برفق داخل أو خارج أنبوب التوجيه (انظر الشكل التكميلي 2 د).
   ملاحظة: عندما يتم قطع أنابيب التوجيه لتكون متدفقة مع سطح الدماغ ، فإن المسافة التي تمتد إليها حزمة سلكية خارج أنبوب التوجيه تتوافق مع الموقع الظهري البطني للمنطقة المستهدفة. يجب أن تكون حزم أسلاك HPC المتحركة متدفقة مع الجزء السفلي من أنبوب التوجيه ، ويجب أن تمتد حزم RSC الثابتة 1.5 مم ، ويجب أن تمتد حزم PFC الثابتة 3.5 مم خارج أنابيب التوجيه. عند دفع أو سحب مجموعات الأسلاك ، احرص على عدم سحب الأسلاك الفردية من بنك الاستثمار الأوروبي في الأعلى أو ثني الجزء السفلي من حزمة الأسلاك.
6. عند محاذاة صفائف الأسلاك الثابتة (RSC و PFC) ، ضع كمية صغيرة من غراء الإيبوكسي القوي على الجزء العلوي من أنابيب التوجيه ، مع لصق الحزم في مكانها. أثناء معالجة الإيبوكسي ، تأكد من أن حزم الأسلاك لا تزال محاذاة بشكل صحيح في الأسفل.
7. لإصلاح صفائف أسلاك HPC المتحركة ، انقل المكوك أولا إلى أعلى موضع مطلوب (في التجارب الموضحة في هذه المقالة ، على الأقل 16 دورة كاملة / 4 مم فوق أدنى موضع). ثم ادفع حزم الأسلاك إلى فتحة المكوك على شكل حرف U وقم بلصقها في مكانها بكمية صغيرة من غراء الإيبوكسي القوي.
   ملاحظة: تأكد من أن الإيبوكسي لا يتدفق أسفل الحزمة في أنبوب البوليميد. عندما يتم علاج الايبوكسي ، ضع طبقة ثانية من الإيبوكسي في نفس المكان لتعزيز الاتصال وتقليل احتمالية انقطاع الاتصال عند نقل المكوك.
8. أدخل بعناية الطرف المفتوح لمجموعة دبوس السلك لسلك GND من خلال أحد الثقوب التي تحمل علامة GND. إصلاحه باستخدام دبوس الذهب.
   ملاحظة: عند استخدام مرحلة رئيسية يتم فيها تقصير قنوات GND والقنوات المرجعية (REF) ، يمكن أيضا استخدام قناة REF إذا كان ذلك أكثر ملاءمة.
9. قم بإزالة محرك الأقراص من الحامل ؛ احرص على عدم ثني أي من مجموعات الأسلاك. أعد توصيل الجزء الأمامي لمحرك الأقراص في نفس الحامل وأدخل 4 مجموعات دبوس سلكي EEG في الفتحات الجانبية لقنوات EEG (المميزة بعلامة 2,4 و 29 و 31) وقم بتثبيتها بدبوس ذهبي لكل منها.
10. بالنسبة لجميع أسلاك GND و EEG ، استخدم مقياسا متعددا في إعداد الاستمرارية للتحقق من الاتصال المستمر بين دبوس الذهب في بنك الاستثمار الأوروبي ودبوس مجموعة دبوس السلك المتصل.
11. قم بتخزين محرك الأقراص. يمكن القيام بذلك ، على سبيل المثال ، عن طريق ربط الغطاء بجسم محرك الأقراص وتخزينه رأسا على عقب.
    ملاحظة: قبل الزرع الجراحي ، قم بتعقيم الجزء السفلي من محرك الأقراص باستخدام الإيثانول. يجب تعقيم جميع مسامير العظام وتجميعات أسلاك GND / EEG في الإيثانول. يجب تعقيم الأدوات الجراحية عن طريق الأوتوكلاف.

10. جراحة زرع محرك الأقراص

ملاحظة: تحدد هذه الخطوة بإيجاز الإجراءات الجراحية لزرع محرك TD. يمكن العثور على بروتوكول زرع أكثر شمولا ، بما في ذلك وصف الأدوات ، وكذلك جرعات وتركيزات الأدوية ، في الملف التكميلي 1.

1. تعقيم الأدوات الجراحية وتنظيف وتعقيم المنطقة الجراحية باتباع الإرشادات المؤسسية المحلية. لتعقيم الغرسات ، ضع أجزاء أسلاك القطب التي ستكون على اتصال مع الدماغ في الإيثانول لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
   ملاحظة: التعرض الطويل للإيثانول أو أبخرته يمكن أن يضعف الغراء cyanoacrylate. إذا لم تكن الأبخرة محاصرة ، فقم بإطالة وقت غمر الأسلاك في الإيثانول. من أجل التحقق من سلامة الغراء ، يوصى بالعثور على الوقت الأمثل باستخدام غرسة اختبار لا تستخدم في تجربة فعلية.
2. توفير التسكين الوقائي اللازم والمضادات الحيوية وتخدير الغازات (إيزوفلوران) وفقا للإرشادات المؤسسية والمحلية.
3. ضع الجرذ في جهاز التجسيم. حلق الجزء العلوي من الرأس وتطهير الجلد مع البوفيدون اليود. ضع مخدرا موضعيا تحت الجلد (يدوكائين) وقم بعمل شق صغير على الجمجمة أعلى خط الوسط.
4. فضح الجمجمة عن طريق سحب الجلد إلى الجانب. إزالة النسيج الضام على الجزء العلوي من الجمجمة ، وتجفيف ، وتنظيف سطح الجمجمة. افصل العضلات الموجودة على جانب الجمجمة برفق للسماح بوضع مسامير التثبيت.
5. قم بقياس إحداثيات البريغما واللامدا. للاستهداف الدقيق ، تأكد من أن سطح الجمجمة مواز للمستوى الأمامي الخلفي المتوسط الجانبي للهيكل الفراغي عن طريق قياس الفرق في الموضع الظهري البطني للبريغما واللامدا. إذا اختلفت الإحداثيات ، اضبط موضع الجرذ في التركيب النمطي عن طريق رفع أو خفض لسان حاله.
6. حدد حج القحف حول المواقع المستهدفة (القشرة قبل الأولية (AP + 3.5 مم و ML + -1 مم) ، خلف الطحال (AP + 5.8 مم و ML + -1 مم والحصين (AP -3.8 مم و ML + - 2.5 مم)).
7. حفر ثقوب لمسامير GND / EEG ومسامير التثبيت. أدخل البراغي وقم بتغطيتها بأكريليك الأسنان السائل. حفر حج القحف وإزالة بعناية الأم الجافية. منع حج القحف من الجفاف عن طريق تطبيق محلول ملحي معقم.
8. ضع محرك TD بعناية أعلى حج القحف ، مع التأكد من تدفق أنابيب التوجيه مع الجمجمة. حماية أنابيب التوجيه مع هلام البترول وإرفاق محرك TD إلى الجمجمة مع الاكريليك الأسنان.
9. اخفض المصفوفات السلكية التي تستهدف HPC ببطء من موقعها الأولي (~ 1.5 مم DV من سطح الدماغ) باتجاه الطبقة الهرمية من الحصين CA1. تم الوصول إلى الطبقة الهرمية تدريجيا في الأيام اللاحقة أثناء فحوصات الإشارة في فترة تعافي الفئران.
10. ضع الغطاء الواقي حول محرك الأقراص.
11. قم بإيقاف تشغيل تخدير الغاز وإزالة الفئران من إطار التجسيم. ضع الفئران في قفص نظيف داخل غرفة ساخنة وقدم الطعام الرطب والماء للتعافي. راقب الجرذ حتى ينشط مرة أخرى ، ويتحرك في القفص ، ويأكل ، ويشرب.
12. أعد الجرذ إلى غرفة السكن. توفير التسكين والرعاية بعد الجراحة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. على سبيل المثال ، راجع مثال بروتوكول الجراحة في الملف التكميلي 1.

11. استرداد بنك الاستثمار الأوروبي

1. في نهاية التجربة ، استرجع محرك الأقراص وقم بإزالة الغطاء الواقي.
2. قم بإزالة دبابيس الذهب وتوصيل أسلاك القطب بعناية. قم بفك بنك الاستثمار الأوروبي من جسم محرك الأقراص. عن طريق دفع الملقط الناعم برفق بين بنك الاستثمار الأوروبي وجسم محرك الأقراص أو رفع بنك الاستثمار الأوروبي بعناية باليد ، حرر الرابطة المتبقية cyanoacrylate التي تثبت بنك الاستثمار الأوروبي على الجسم.
3. قم بتنظيف بنك الاستثمار الأوروبي والدبابيس الذهبية لإعادة استخدامها على غرسات TD Drive اللاحقة. قبل إعادة استخدام بنك الاستثمار الأوروبي ، تحقق من فتحات دبوس الذهب والموصل عالي الكثافة للتآكل. أعد استخدام بنك الاستثمار الأوروبي فقط إذا كانت فتحات التهوية سليمة بما يكفي للسماح باتصال جيد بين دبابيس الذهب وأسلاك الأقطاب الكهربائية وبنك الاستثمار الأوروبي وإذا كان اتصال الموصل عالي الكثافة بالمرحلة الأمامية لا يزال مستقرا بدرجة كافية.

النتائج

باستخدام الإرشادات الواردة في البروتوكول ، يمكن إنشاء محرك TD بسهولة بواسطة العديد من المجربين. بعد تطوير محرك الأقراص (n = 4) ، تم تشغيل طيار كامل مع ثمانية. تم زرع مجموعة إضافية من ثمانية ، وتم جمع البيانات التجريبية. نظرا لعدم اكتمال تحليل البيانات حول هذه ، فقد تم تضمينها...

Discussion

يظهر في هذه المقالة غرسة قابلة للتكيف لتسجيلات القطب السلكي الثنائي المتماثل متعدد المناطق للفئران التي تتحرك بحرية.

كانت القدرة على ضبط الغرسة بسهولة عن طريق تغيير المعلمات المحددة مسبقا أحد الدوافع لإنشاء محرك TD. وبينما تهدف إلى زيادة المرونة إلى أقصى ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm drill bit	McMaster	2951A38
1.27 mm pitch interconnected SIP/DIP socket (Mill-Max)	Mouser Electronic	575-003101	For essembling and connection of EEG & GND screws
5 minute epoxy	Bison	Commercially available	regular off-the-shelf epoxy
cyanoacrylate glue	Loctite		Super Glue-3
EEG wire	Science Products GmbH	7SS-2T
Electrode wire	Science Products GmbH	NC7620F
Ethanol	LC		For standard pre-operative sterilization procedure of drive
Fine forceps (5)	FST	91150-20	For wire bundle preperation and handling
Form 3B	Formlabs		3D printer used to 3D print the self-printed parts of the TD drive
Gold pins (small)	Neuralynx, Inc.	9885	Attachment of electorde wires to EIB board
Ground wire	Science Products GmbH	SS-3T/A
High-density connector	LabMaker GmbH/Omnetics	A79026-001
Lister Hodded rats	Charles River Laboratories	Crl:LIS	we used male rats, 9-12 weeks of age at arrival
M1 brass insert	AliExpress	Commercially available	https://aliexpress.com/item/33047616164.html
M1 tap	McMaster	2504A33
M1x16 screw	Bossard	1096613
M1x3 stainless steel screws	Screws and More	84213_14985
M2.5x5 polyimide screws	Screws and more	7985PA25S_50
mineral oil	McMaster	1244K14
Nail polish	Etos	Commercially available	For color coding EEG and GND wires
painter's tape	Gamma	Commercially available	For wire bundle preperation
Pin vise	McMaster	8455A16
plotting paper	Canson	Commercially available	For wire bundle preperation
polyimide tubes	Amazon / Small Parts	TWPT-0159-30-50	AWG, 0.0159" ID, 0.0219" OD, 0.0030" Wall, 30" Length
RHD 32-channel headstage with accelerometer	Intan Technologies, LLC	C3324	For tethered recordings in the sleepbox
RHD 3-ft (0.9 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3203	From commutator to headstage
RHD 6-ft (1.8 m) standard SPI cables	Intan Technologies, LLC	C3206	From OpenEphys box to commutator
Slip Ring with Flange	Adafruit	1196	Commutator: 22 mm diameter, 12 wires
Solder flux	Griffon S-39 50 ml	Commercially available	For soldering EEG & GND screws
soldering paste	Amazon	B08CBZ5HC5
stainless steel M2 nut	McMaster	93935A305
Tethered recording setup	OpenEphys	Acquasition Board
Wireless recording logger	SpikeGadgets	miniLogger 32	For wireless recordings in the task
Wireless recording setup	SpikeGadgets	Main Control Unit (MCU) incl. breakout board and RF transceiver	For wireless recordings in the task