JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نعرض بروتوكول التصوير لمراقبة التفاعلات الجزيئية الحيوية مع التنصت على الرنين الحراري الضوئي (PORT) ، حيث قمنا بتحسين معلمات التصوير ، وتحديد حدود النظام ، والتحقيق في التحسينات المحتملة في تصوير مجموعة شكل الحمض النووي ثلاثي النجوم.

Abstract

الفحص المجهري عالي السرعة للقوة الذرية (HS-AFM) هو تقنية تصوير جزيئي شائعة لتصور العمليات البيولوجية أحادية الجزيء في الوقت الفعلي نظرا لقدرتها على التصوير في ظل الظروف الفسيولوجية في البيئات السائلة. يستخدم وضع التنصت على الرنين الكهروضوئي (PORT) ليزر محرك لتذبذب الكابول بطريقة خاضعة للرقابة. هذا التشغيل الكابولي المباشر فعال في المدى MHz. إلى جانب تشغيل حلقة التغذية الراجعة على منحنى قوة المجال الزمني بدلا من سعة الرنين ، يتيح PORT التصوير عالي السرعة بسرعة تصل إلى عشرة إطارات في الثانية مع التحكم المباشر في قوى عينة الطرف. وقد ثبت أن PORT يتيح تصوير ديناميكيات التجميع الدقيقة والمراقبة الدقيقة للأنماط التي تشكلها الجزيئات الحيوية. حتى الآن ، تم استخدام هذه التقنية لمجموعة متنوعة من الدراسات الديناميكية في المختبر ، بما في ذلك أنماط تجميع شكل الحمض النووي المكون من 3 نقاط الموضحة في هذا العمل. من خلال سلسلة من التجارب ، يحدد هذا البروتوكول بشكل منهجي إعدادات معلمات التصوير المثلى والحدود النهائية لنظام التصوير HS-PORT AFM وكيف تؤثر على عمليات التجميع الجزيئي الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يحقق في التأثيرات الحرارية المحتملة غير المرغوب فيها التي يسببها ليزر القيادة على العينة والسائل المحيط بها ، خاصة عندما يقتصر المسح على مناطق صغيرة. توفر هذه النتائج رؤى قيمة من شأنها أن تدفع إلى تقدم تطبيق وضع PORT في دراسة الأنظمة البيولوجية المعقدة.

Introduction

الفحص المجهري للقوة الذرية عالية السرعة (HS-AFM) هو تقنية تصوير سريعة النمو1،2،3،4. إنه يعمل بسرعات تسمح للباحثين بتصور التفاعلات الجزيئية الحيوية في الوقت الفعلي5،6،7،8،9. التنصت على الرنين الحراري الضوئي (PORT) هو وضع تصوير خارج الرنين مشابه للتنصت على قوة الذروة10،11 أو وضع القوة النبضية12،13 أو وضع القفز14. ومع ذلك ، بدلا من تأرجح الماسح الضوئي عموديا ، يتأرجح PORT عموديا فقط الكابولي من خلال ليزر إثارة يركز على الكابولي (عادة ما يكون قريبا من نقطة التثبيت). يتشوه الكابولي بسبب التأثير ثنائي الشكل: يقوم ليزر الإثارة المعدل بالطاقة بتسخين الكابولي المطلي بشكل دوري ، والذي ينحني بسبب معاملات التمدد الحراري المختلفة للناتئ وموادالطلاء 15. يمكن تقليل تسخين الكابولي والعينة باستخدام ليزر محرك يتم إيقاف تشغيله وإعادة تشغيله بشكل دوري خلال كل دورة تذبذب ، بدلا من استخدام محرك جيبي كامل5.

تم استخدام الحمض النووي لتشكيل زخارف ذات صلة بيولوجيا ومثيرة للاهتمام من الناحية الهيكلية ومفيدة كيميائيا حيويا لعدد من السنوات16،17،18،19،20. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن هياكل الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لتوصيف جودة تصوير AFM21 وتقييم تأثير طرف AFM22 عالي السرعة. أصبحت نجوم الحمض النووي ثلاثية النقاط (3PS) عملية كنظام نموذجي قابل للبرمجة للتحقيق في التنظيم فوق الجزيئي للجزيئات ذات البنية المماثلة في الأنظمة البيولوجية المعقدة19. في السابق ، تم تتبع التجميع الذاتي للمشابك التي تشكلت بواسطة مونومرات الحمض النووي ثلاثية النهايات الحادة عبر HS-AFM23. في النهاية ، يتم تنظيمها في شبكات كبيرة بترتيب سداسي. هنا ، يتم تصوير التجميع الذاتي لنجوم الحمض النووي المكونة من 3 نقاط19 باستخدام تقنية PORT بسرعات مسح سريعة بما يكفي لتتبع التجميع الذاتي وآليات التصحيحالخاصة به 24 مع ضمان الحد الأدنى من التعطيل للعملية أو تلف العينة. كما هو الحال مع أي وضع HS-AFM ، هناك مفاضلة بين جودة التصوير القابلة للتحقيق وسرعة التصوير والاضطراب غير المرغوب فيه للعينة. من خلال اختيار الحل الوسط الصحيح ، يمكن للمرء أن يفهم بشكل أفضل أنماط التنظيم الذاتي للتجمعات فوق الجزيئية. لذلك ، سيستخدم هذا البروتوكول إعدادا مشابها مع DNA 3PS كنظام نموذجي لتحسين المعلمات الخاصة ب PORT. سيسمح ذلك بالتشغيل بسرعات تصوير عالية بأحجام مسح كبيرة بما يكفي مع تقليل تلف العينة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. عينة ومخازن مؤقتة

ملاحظة: بلاط الحمض النووي المستخدم في هذه الدراسة هو شكل 3 نقاط من النجوم تم تطويره في مختبر ماو في جامعة بوردو19،25. تم شراء جميع قليل النوكليوتيدات المستخدمة في هذه الدراسة من شركة Integrated DNA Technologies، Inc. اجمع المواد والكواشف اللازمة.

  1. امزج الحمض النووي أحادي الشريطة (ssDNAs) بنسبة مولارية 1: 3: 3 (S1 0.6 ميكرومتر ، 1.8 ميكرومتر ل S2 ، و 1.8 ميكرومتر ل S3) في المخزن المؤقت للتلدين (5 ملي مولار TRIS ، 1 ملي مولار EDTA ، و 10 ملي مولار MgAc2). يجب أن يكون التركيز النهائي لحزية الحمض النووي 0.6 ميكرومتر (49 نانوغرام / ميكرولتر مع الوزن الجزيئي 3PS 82020.3 جم / مول).
  2. ضع محلول الحمض النووي في وعاء مقاوم للحرارة وقم بتسخينه إلى 80 درجة مئوية. قم بتبريد محلول الحمض النووي ببطء من 80 درجة مئوية إلى 20 درجة مئوية خلال فترة 4 ساعات. تساعد عملية التلدين هذه قليل النوكليوتيدات ssDNA على تشكيل شكل الحمض النووي المزدوج المطلوب.
  3. للتنقية ، قم بتحميل محلول الحمض النووي الملدن على جل الاغاروز بنسبة 3٪ لإزالة SSDNA الزائدة وأي منتج جانبي غير مرغوب فيه. قم بتشغيل هلام 3٪ عند 60 فولت لمدة 2.5 ساعة في مخزن مؤقت قيد التشغيل يحتوي على 0.5x Tris-Borate-EDTA (TBE) و 10 ملي ملي مجم (CH3COO) 2.
  4. حدد وحدد موقع الشريط الموجود على الجل الذي يحتوي على شكل الحمض النووي. تأكد من أن النطاق قد انتقل إلى موضع معين بناء على حجمه.
  5. استئصال الشريط الذي يحتوي على شكل الحمض النووي من الجل بعناية. استخرج شكل الحمض النووي من جزء الهلام المستأصل عن طريق وضعه في عمود دوران لاستخراج الهلام والطرد المركزي عند 3,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  6. استبدل المخزن المؤقت في شكل الحمض النووي المستخرج بمخزن التلدين باستخدام مكثف الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم في درجة حرارة الغرفة (أو أقل) حتى يصبح المحلول المركز أقل من 100 ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلدين وكرر هذه الخطوة مرتين لضمان استبدال المخزن المؤقت.
  7. تمييع شكل الحمض النووي إلى 6 نانومتر لأغراض التصوير. استخدم مقياس الطيف الضوئي أو غيرها من الطرق المناسبة لتحديد التركيز وضبطه بدقة. عزر الحمض النووي جاهز الآن للتصوير.
    ملاحظة: جميع المخازن المؤقتة في البروتوكول هي الأس الهيدروجيني 8.0. وفيما يلي معلومات التسلسل للنطاقات الثلاثة المعنية:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. نمو طرف ناتئ

  1. تركيب الكابولي على حامل ناتئ SEM: تأكد من أن الكابولي نظيف وخالي من أي ملوثات. قم بتركيب الكابولات على حامل مناسب متوافق مع نظام SEM. يمكن مشاركة تصميم حامل الكابولي المصمم خصيصا عند الطلب.
  2. حقن الغاز: قم بتسخين غاز السلائف (على سبيل المثال ، سلائف الفينانثرين C14H10 لأطراف الكربون غير المتبلورة) لاستخدامها في نظام حقن الغاز لزراعة الطرف الجديد. بمجرد أن يكون الفراغ أقل من 10-5 ملي بار ، قم بتطهير خط حقن الغاز 10 مرات لمدة 2 ثانية للتأكد من عدم وجود هواء متبقي غير مرغوب فيه في خط الفوهة (يجب أن يتم ذلك مع إغلاق الصمام إلى غرفة البندقية).
  3. تعديل موضع الطرف: استخدم المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لتحديد موقع نهاية الكابولي. قم بإمالة حامل الكابولي إلى زاوية (على سبيل المثال ، 11 درجة في هذه الحالة) تعادل تلك التي سيقدمها الكابول عند وضعه على حامل ناتئ AFM فيما يتعلق بالسطح بحيث يكون الطرف المزروع عموديا على السطح أثناء التصوير. اضبط موضع وتركيز المحرك SEM للحصول على رؤية واضحة لطرف الكابول ، حيث سيتم زراعة طرف نانو كربوني حاد.
  4. الترسيب المستحث بشعاع الإلكترون المركز (FEBID):
    1. قم بتعيين معلمات الترسيب على البرنامج المحدد (في هذه الحالة ، SmartFIB) ، مثل تيار الحزمة (I) وجهد التسارع (V) ، ومسافة العمل (WD) ، والتكبير ، والشكل المكشوف ، ووقت الجرعة / الترسيب ، ووقت السكون. تم استخدام المعلمات التالية لزراعة أطراف كربون غير متبلورة ، والتي تقدم خصائص ميكانيكية جيدة لتصوير AFM ، مما يؤدي إلى أطوال حوالي 130 نانومتر ونصف قطر في حدود 2-4 نانومتر:
      حدد البقعة / النقطة كشكل مكشوف
      WD = 5 مم
      أنا = 78 باسكال ، و V = 5 كيلو فولت
      وقت المكوث = 1 ميكرو ثانية
      الجرعة = 0.05 نانوثانية ، ووقت الترسيب = 0.64 ثانية
      التكبير = 20000x
    2. ابدأ عملية الترسيب لتنمية الطرف عن طريق تشعيع شعاع الإلكترون في بقعة على طرف الكابولي أثناء حقن غاز السلائف في نفس الوقت ، وإغلاق الغاز عند الانتهاء من الترسيب. في هذه الحالة ، يقوم برنامج SmartFIB بذلك تلقائيا بعد إعداد الوصفة المذكورة أعلاه.
  5. تحليل ما بعد النمو: قم بإجراء تصوير SEM بعد النمو لفحص الطرف المزروع حديثا والتأكد من جودته وخصائصه (نصف قطر الطرف وطوله). انتظر 1-2 دقيقة بعد نمو الطرف للتأكد من ضخ كل غاز السليفة لتجنب إعادة الترسيب أثناء تصوير SEM. قم بإزالة حامل العينة من غرفة SEM.
  6. إعادة تدوير الكابولي: في حالة تثبيت نظام SEM أيضا على شعاع أيوني مركزة مدمج (FIB) ، قم بإزالة الطرف التالف أو المتسخ الذي تم نميته مسبقا عن طريق طحنه بنظام FIB باستخدام تيارات FIB منخفضة (على سبيل المثال ، 1 باسكال ، لتجنب تلف الكابول). قم بإجراء إزالة الطرف عن طريق الطحن في شكل مقطع عرضي ، من طرف الطرف إلى القاعدة ، لتجنب انهيار الطرف. سيسمح هذا بإعادة نمو واحدة جديدة.

3. أجهزة HS-AFM

  1. يتكون إعداد التصوير من رأس PORT5 ، 26 (الشكل 1 أ) ، والماسح الضوئي عالي السرعة26 مع قرص عينة مع الميكا في الأعلى ، ووحدة تحكم متوافقة27 ، ومضخم الجهد العالي مع النطاق الترددي العالي المطلوب للتصوير عالي السرعة ، وقاعدة AFM ، والكمبيوتر الشخصي مع البرنامج المطلوب للتحكم في المعدات المذكورة أعلاه27.
    ملاحظة: في هذه الحالة ، هذه مكونات مفتوحة المصدر يمكن الحصول على خطط لها من مختبر الأجهزة الحيوية والنانوية في EPFL27 ، 28. من الممكن أيضا حضور ورش عمل حول كيفية بناء رأس PORT ووحدة التحكم29 ، بالإضافة إلى تنزيل واستخدام البرنامج المستند إلى LabView.
  2. ضع ناتئا قصيرا جدا (على سبيل المثال ، AC10DS أو ما يعادله) بحذر تحت مشبك الزنبرك على حامل الكابول باستخدام الملقط. تأكد من أن شريحة الكابولي ثابتة ومستقرة.
  3. أضف 50 ميكرولتر من السائل باستخدام حقنة عبر منفذ وصول السائل الأيسر ، كما هو موضح في الشكل 1 ب. مع استمرار إيقاف تشغيل ليزر الإثارة ، قم بمحاذاة ليزر القراءة على الكابولي باستخدام المقابض الثلاثة المخصصة على رأس AFM الموضحة في الشكل 1 أ. افعل ذلك عن طريق مراقبة ظل الكابولي على ورقة بيضاء مع تعظيم المجموع (طريقة الظل). بعد ذلك ، قم بتوسيط بقعة الليزر على الصمام الثنائي الضوئي باستخدام المقابض المخصصة.
  4. قم بتشغيل ليزر محرك الأقراص ومحاذاة الجهاز عن طريق تحديد مربع تمكين الإثارة في Excitation VI ، بحيث يقوم بتشغيل الكابولي وتأرجحه. إظهار إشارة الإثارة الكابولية وإشارة انحراف الكابولي على راسم الذبذبات المتصل. إذا كان تذبذب الانحراف منخفضا جدا (أو غير موجود) فقد يكون ليزر القيادة بعيدا جدا عن الكابولي. في هذه الحالة ، استخدم طريقة الظل وقم بإيقاف تشغيل ليزر الانحراف لتسهيل المحاذاة. قم بزيادة سعة التذبذب إلى أقصى حد باستخدام مقابض ضبط ليزر القيادة الموضحة في الشكل 1 أ.
  5. لضبط سعة التذبذب الكابولي في PORT ، أدخل في التحكم المقابل للبرنامج الجهد من الذروة إلى الذروة المرسل إلى دائرة التحكم في الصمام الثنائي بالليزر (من الآن فصاعدا ، إدخال التيار المتردد من الذروة إلى الذروة) في Excitation VI. للحفاظ على الصمام الثنائي لليزر في نظام التوصيل ، وبالتالي الليزر ، أضف جهد تيار مستمر إلى دائرة التحكم في الصمام الثنائي بالليزر (من الآن فصاعدا ، إدخال إزاحة التيار المستمر) ، والذي يتم أيضا من صندوق التكوين في Excitation VI. سيؤثر كلاهما أيضا على طاقة الليزر ، والتي يمكن قياسها باستخدام مقياس طاقة الليزر وتستخدم لضبط سعة تذبذب الكابولي.
  6. حدد الحد الأقصى لتردد الإثارة الحرارية الضوئية الذي يمكن تطبيقه على الكابولي ، والذي يجب أن يكون أقل من تردد الرنين للناتئ. حدد تردد الرنين عن طريق نغمة حرارية أو مسح التردد. الكابولات المستخدمة في هذه الدراسة (AC10DS) ، التي يبلغ تردد رنينها في السوائل حوالي 400 كيلو هرتز (1 ميجاهرتز في الهواء) 30 ، لها منطقة انحناء شبه استثنائية أقل من 300 كيلو هرتز5. وبالتالي ، يجب استخدام ترددات PORT أقل من هذا الحد (حوالي 100-200 كيلو هرتز).
  7. اضبط معلمات التصوير وإعداداته لمعدل PORT ومعدل المسح الضوئي إلى القيم المطلوبة في Excitation وScan Vis على التوالي (المعلمات المستخدمة في هذه المقالة مذكورة في أوصاف الشكل). بمجرد تكوين معلمات الإعداد والتصوير ، قم بإجراء تجارب التصوير المطلوبة لمراقبة وتتبع التفاعلات الجزيئية.
    ملاحظة: نظرا لعدم بيع الكابولات AC10DS ، فقد يلزم استخدام بديل مثل Fastscan D أو BioLever31 حتى يتوفر ما يعادله.

4. الحصول على منحنيات التفاعل المناسبة

  1. في البداية، اقترب من سطح العينة في وضع التلامس بالنقر فوق ابدأ على Z-controller VI الذي تم تعيينه على وضع الاتصال.
    1. في هذا الوضع، يتلامس طرف AFM بشكل مباشر مع العينة. بمجرد الوصول إلى السطح ، قم بإجراء منحنى القوة مقابل المسافة في المنحدر السادس للحصول على معايرة حساسية انحراف الكابولي.
    2. أيضا ، قم بتقدير ثابت الزنبرك الكابولي ، إما من مواصفات مزود الكابولي (أقل دقة) ، التي تم الحصول عليها باستخدام مقياس التداخل ، أو من خلال معايرة قائمة على الضبط الحراري بعد معايرة حساسية الانحراف. تعد المعايرة الدقيقة للناتئ ضرورية للتحكم الدقيق في قوة عينة الطرف.
  2. بعد سحب Z-piezo تماما من السطح حيث لا يمكن للطرف الوصول إلى السطح بالنقر فوق Up في Z controller VI ، قم بالتبديل إلى وضع PORT في Z controller VI ، وقم بتشغيل ليزر الإثارة في خانة الاختيار Excitation VI. للبدء ، اضبط وضع PORT للعمل بالتردد المطلوب في Excitation VI ، والذي ، في هذه الحالة التجريبية ، هو 100 كيلو هرتز ، باستخدام ناتئ AC10DS.
  3. سجل التذبذب الخالي من الكابولي قريبا ولكن لا يلمس السطح. بعد ذلك، قم بتشغيل الملاحظات في وحدة التحكم Z عند ملامسة السطح للتسجيل وانقر فوق تصحيح للحصول على تذبذب الكابولي عندما يكون الكابول ملامسا للسطح بشكل متقطع، وكلاهما بالنانومتر. اطرح منحنى التذبذب الحر من منحنى التلامس المتقطع للحصول على منحنى التفاعل الحقيقي ، وتحويله إلى pN باستخدام ثابت الزنبرك الكابولي (في هذه الحالة ، 0.1 نيوتن / م).

5. تصوير HS-AFM

  1. تحضير محلول Mg (CH3COO) 2 بتركيز 10 مليمتر. باستخدام حقنة هاميلتون ، قم بحقن 50 ميكرولتر من محلول 10 ملي مولار مجم (CH3COO) 2 المحضر في القناة السائلة لحامل الكابولي ، مما ينتج عنه قطرة من السائل تحيط بالناتئ.
  2. اقترب تدريجيا من الكابول إلى السطح بالنقر فوق Start on Z Controller VI. بمجرد اكتشاف السطح ، أدر ملف التغذية الراجعة ، وابحث عن ذروة منحنى التفاعل في منحنيات قوة ORT VI. ابحث عن أدنى نقطة ضبط للقوة تسمح بالتتبع الصحيح (أقل من 300 pN لتجنب إتلاف العينات الحيوية الهشة).
  3. اضبط حجم المسح الضوئي في المسح الضوئي VI على 800 نانومتر × 800 نانومتر ومعدل الخط على 100 هرتز. امسح السطح ضوئيا بالنقر فوق سهم الإطار (لأسفل) في المسح الضوئي VI للتحقق من جودة السطح. إذا تم الكشف عن أي تلوثات ، فقم بمعالجة المشكلة عن طريق تنظيف السطح و / أو الكابولي و / أو حامل الكابولي قبل المتابعة.
  4. بعد المسح الضوئي ، اسحب الكابولي من السطح بالنقر فوق سحب في وحدة التحكم Z VI. قم بإزالة المحلول العازل من الفتحة الموجودة في حامل الكابول باستخدام حقنة هاميلتون لمنع مشكلات الحجم الميت.
  5. قم بإعداد محلول DNA 3PS المخفف من الجزء 1 من البروتوكول. حقن 50 ميكرولتر من محلول الحمض النووي المخفف 3PS في القناة المخصصة لحامل الكابول.
  6. ابدأ عملية التصوير بتكرار الخطوات 5.2-5.3، ومسح منطقة 800 نانومتر × 800 نانومتر بمعدل خط افتراضي يبلغ 100 هرتز (256 سطرا × 256 بكسل). بعد الفحص الأولي، اضبط حجم التصوير وسرعته في Scan VI على القيم المحددة للحصول على مزيد من البيانات.
  7. احتفظ بنقطة ضبط قوة الإدخال لتفاعل العينة في مربع نقطة ضبط Z Controller VI عند أدنى مستوى مطلوب للتتبع الصحيح (أقل من 300 pN) طوال عملية التصوير لتقليل تلف العينة / إزعاجها ما لم ينص على خلاف ذلك. كرر هذه العملية لجميع مناطق العينة المطلوبة.

6. معالجة الصور

  1. قم بإعداد البيئة لتشغيل التعليمات البرمجية لمعالجة الدفعات المخصصة Pygwy (Python for Gwyddion) ، مما يضمن أن Python وجميع المكتبات اللازمة. يمكن العثور على مزيد من المعلومات على موقع Gwyddion على الويب32 مثبتة بشكل صحيح على النظام. هذا يضمن تشغيل الكود بسلاسة ويمكنه الوصول إلى الوظائف المطلوبة.
  2. افتح كود معالجة دفعة Pygwy المخصص (متوفر عند الطلب). سيوفر ذلك الوصول إلى الأدوات والوظائف اللازمة لمعالجة الصور وتحليلها.
  3. ابدأ معالجة الصور عن طريق إجراء تصحيح الخط المتوسط الأفقي على الصور. تهدف هذه الخطوة إلى إزالة أي مخالفات أو قطع أثرية موجودة في خطوط المسح ، مما يضمن أن خطوات المعالجة اللاحقة تستند إلى بيانات دقيقة. بعد إزالة خلفية المستوى، قم بتطبيق تصحيح الخط. استخدم إزالة الندبات لتحسين الصور بشكل أكبر عن طريق إزالة أي علامات أو عيوب غير مرغوب فيها ناتجة عن عوامل خارجية. تعمل هذه الخطوة على تحسين المظهر المرئي العام للصور.
  4. قم بتحسين رؤية الصور وتباينها عن طريق ضبط خريطة ارتفاع الألوان. هذا يضمن تصور الميزات ذات الأهمية بوضوح وإبرازها في الصور.
  5. حدد الصور المعالجة التي تحتاج إلى دمجها في مقطع فيديو. حدد معدل الإطارات المطلوب للفيديو. في هذه الحالة ، اضبطه على 7 إطارات في الثانية (fps).
  6. احسب مدة كل إطار. استخدم فيجي (ImageJ) لدمج الصور التي تمت معالجتها في مقطع فيديو. تأكد من ضبط معدل الإطارات ومدة الإطار بشكل صحيح.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذا التحقيق ، لوحظت بنجاح عملية التجميع الديناميكية لأشكال الحمض النووي ذات النجوم المكونة من 3 نقاط في جزر مستقرة باستخدام قدرات HS-PORT AFM. سمحت لنا هذه التقنية بالتقاط تجميع هذه الهياكل في الوقت الفعلي. في الشكل 2 أ ، ب ، نحصل على مسح ضوئي واضح ل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عند تصوير عينات بيولوجية حساسة ، تكون أوضاع التصوير غير الرنين في AFM مفيدة بشكل خاص لأنها يمكن أن تتحكم بشكل مباشر في قوى تفاعل عينة الطرف10. من بينها ، يبرز وضع PORT بسبب معدلات التذبذب الأعلى التي يمكن أن يصل إليها ، مما يتيح معدلات مسح أعلى. نظرا لأن PORT يقوم بت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

Acknowledgements

يشكر المؤلفون رافائيل زينغ للمساعدة في برمجة نص Python لمعالجة سلسلة الصور. يقر مرفق البيئة العالمية بالتمويل المقدم من برنامج إطاري للبحث والابتكار في مبادرة أفق 2020 - الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار (2014-2020). ERC-2017-CoG; في الخلية. رقم المشروع 773091. يقر VC بأن هذا المشروع قد تلقى تمويلا من برنامج Horizon 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة Marie Skłodowska-Curie رقم 754354. تم دعم هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم من خلال منحة 200021_182562.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Discontinued 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Electrophoresis  unit
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xthermocycler for annealing
Custom AFM setupLaboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale LausanneObtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTAITW ReagentsA5097In annealing buffer
Laser Power MeterThorlabsPM100DDigital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310Major ScienceMP-310Electrophoresis Power Supply
MgAc2ABCR GmbHAB544692In annealing buffer
TBEThermo Scientific327330010Running buffer for electrophoresis
TRISBio-Rad1610719In annealing buffer

References

  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HS AFM PORT 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved