توصيف أنظمة تدفق الأدوية المتعددة في الراكدة البوماني باستخدام سلالة بكتيرية تعاني من نقص التدفق ونظام التعبير الجيني أحادي النسخة

Summary

وصفنا إجراء سهلا لتكملة الكروموسومات أحادية النسخة لجين مضخة التدفق باستخدام نظام تعبير صغير قائم على Tn7 في سلالة مهندسة تعاني من نقص التدفق من Acinetobacter baumannii. تسمح هذه الأداة الجينية الدقيقة بالتعبير الجيني الخاضع للرقابة ، وهو أمر أساسي لتوصيف مضخات التدفق في مسببات الأمراض المقاومة للأدوية المتعددة.

Abstract

يتم التعرف على Acinetobacter baumannii كممرض صعب سالبة الجرام بسبب مقاومته الواسعة للمضادات الحيوية. من الأهمية بمكان فهم الآليات الكامنة وراء هذه المقاومة لتصميم خيارات علاجية جديدة وفعالة. لسوء الحظ ، فإن قدرتنا على التحقيق في هذه الآليات في A. baumannii يعوقها ندرة أدوات التلاعب الجيني المناسبة. هنا ، نصف طرق استخدام نظام قائم على الكروموسومات المصغرة Tn7 لتحقيق التعبير الجيني أحادي النسخة في سلالة A. baumannii التي تفتقر إلى آليات التدفق الوظيفية من نوع RND. يعد إدخال نسخة واحدة وتعبير مضخة التدفق المستحث مفيدا جدا ، حيث أن وجود operons تدفق RND على البلازميدات ذات العدد العالي غالبا ما تتحمله الخلايا البكتيرية بشكل سيئ. علاوة على ذلك ، فإن دمج متجهات التعبير الصغيرة Tn7 المؤتلفة في كروموسوم مضيف بديل A. baumannii مع زيادة حساسية التدفق يساعد على التحايل على التداخل من مضخات التدفق الأخرى. هذا النظام ذو قيمة ليس فقط للتحقيق في مضخات التدفق البكتيري غير المميزة ولكن أيضا لتقييم فعالية المثبطات المحتملة التي تستهدف هذه المضخات.

Introduction

Acinetobacter baumannii هو أحد مسببات الأمراض ذات الأولوية القصوى لمنظمة الصحة العالمية نظرا لمقاومته الشاملة لجميع فئات المضادات الحيوية¹. إنه ممرض انتهازي يؤثر في الغالب على الأشخاص في المستشفى أو المصابين أو الذين يعانون من نقص المناعة. A. baumannii يتهرب إلى حد كبير من المضادات الحيوية عن طريق مضخات التدفق ، وأكثرها صلة هي عائلة مصدري قسم المقاومة (RND)². إن فهم كيفية عمل مضخات التدفق هذه ميكانيكيا سيسمح للمرء بتطوير خيارات علاجية مستهدفة.

إحدى الطرق الشائعة التي يمكن من خلالها تمييز العمليات الخلوية على وجه التحديد هي من خلال التلاعب الجيني. ومع ذلك ، فإن الأدوا....

Protocol

1. التحضير التجريبي

1. تنقية البلازميد pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (إدخال البلازميد ، الشكل 2A) مع الجين محل الاهتمام.
   ملاحظة: هنا ، الجين محل الاهتمام هو adeIJK. يجب أن يكون تركيز البلازميد النهائي ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
2. تنقية البلازميد المساعد (pTNS2)⁹ وبلازميد الاستئصال (pFLP2^ab)⁶ (الشكل 2B ، C ، على التوالي) ، من الناحية المثالية إلى تركيز الحمض النووي البلازميد النهائي من ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
3. تحضير 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء و 25 مل من مرق....

النتائج

يستغرق إجراء إدخال الكروموسومات 2 ساعة فقط إجمالا خلال 3 أيام لرؤية مستعمرات النتيجة تنمو على صفيحة أجار انتقائية (الشكل 1A-C). يعتمد العدد المتوقع للمستعمرات على لوحة التحويل على الإجهاد: يمكن للمرء أن يرى 20-30 أو حتى مئات المستعمرات حيث أن إدخال Tn7 في مواقع <.......

Discussion

على الرغم من أن هذا الإجراء الخاص بالإدخال الكروموسومي لنظام التعبير الجيني أحادي النسخة القابل للحث في A. baumannii واضح تقنيا وليس كثيف العمالة ، إلا أن هناك بعض الخطوات المهمة التي يجب التأكيد عليها. أولا ، يجب أن يتم تحضير الخلايا المختصة على الجليد قدر الإمكان حيث تصبح الخلايا هشة أثن.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates