تقنيات لأخذ عينات سريعة من ستة أعضاء حاسمة في Xenopus البالغين

Summary

تقدم هذه المقالة دليلا لأخذ عينات من ستة أعضاء مهمة ومتنوعة في Xenopus للبالغين يمكن الوصول إليها بسرعة وسهولة: بطين القلب وشحمة الكبد والبنكرياس والأجسام الدهنية والكلى المقترنة والجلد.

Abstract

كان Xenopus كائنا نموذجيا قويا لفهم تطور الفقاريات وأمراضها لأكثر من مائة عام. في حين تم توثيق التحليل التجريبي وتقنيات تشريح الجنين بشكل جيد ، لم يتم تحديث أوصاف هياكل وأعضاء Xenopus البالغة ، جنبا إلى جنب مع تقنيات العمل مع البالغين ، لمراعاة متطلبات الأساليب الحديثة مثل البروتينات الكمية والنسخ أحادي الخلية. تتطلب وجهات النظر من نوع الخلية والجينات ملاحظات متناقضة في المراحل الجنينية لتلك الموجودة في الأنسجة البالغة. تخضع أعضاء اليرقة لتغييرات كبيرة في هيكلها العام ، ومورفولوجيتها ، وموقعها التشريحي على طول انتقال اليرقات إلى البالغين ، وعلى الأخص أثناء إعادة تشكيل التحول الهائل. يعد وضع معايير قوية لتحديد الأعضاء وتشريحها أمرا بالغ الأهمية لضمان اتساق مجموعات البيانات الناتجة عن الدراسات التي أجريت في مختبرات مختلفة. يحدد البروتوكول الحالي ستة من الأعضاء في Xenopus البالغ ، مما يوضح طرق تشريح وأخذ عينات من بطين القلب والكبد والجسم الدهني والبنكرياس والكلى المزدوجة وجلد Xenopus البالغ. اعتمادا على طرق الحفظ ، يمكن استخدام الأعضاء المشرحة للبروتينات الكمية ، ونسخ الخلية المفردة / النوى ، والتهجين في الموقع ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية ، والأنسجة ، إلخ. يهدف هذا البروتوكول إلى توحيد أخذ عينات الأنسجة وتسهيل التحقيقات متعددة المختبرات لأنظمة الأعضاء البالغة.

Introduction

على الرغم من أن "التشريح الرقمي" ل Xenopus البالغ " متاح¹ ، إلا أن أخذ عينات الأعضاء والأنسجة القابلة للتكرار من Xenopus البالغ لا يزال يمثل تحديا بدون التعليمات التفصيلية المتاحة لنماذج البالغين الأخرى (مثل الفئران^2،3،4). تهدف هذه المقالة إلى توفير إرشادات واضحة لأخذ عينات دقيقة وقابلة للتكرار من أعضاء Xenopus البالغة على غرار ما هو متاح حاليا ليرقاتها⁵. يتم التركيز على سهولة الإكمال للحفاظ على أقصى قدر من النضارة وجعل البروتوكول في متناول جميع المستخدمين.

على الرغم من وجود دليل تشريح شامل ل Rana ^sp.6 ، بالإضافة إلى العديد من أدلة تشريح الفصول الدراسية ل anurans⁷ الأخرى ، لا يتوفر حاليا دليل تشريح وأخذ عينات Xenopus. بالنسبة لأولئك الذين ليسوا على دراية بممارسات أخذ العينات أو تشريح البرمائيات ، فإن الاختلافات الصغيرة بين Xenopus و anurans الأخرى تجعل هذه الموارد دون المستوى الأمثل لأخذ عينات الأنسجة القابلة للتكرار.

لم يتم تضمين العديد من الأنسجة القيمة بل يتم التخلص منها في هذا الدليل ؛ هذا لضمان نضارة الأنسجة. ست عينات محدودة بما يكفي لضمان إمكانية جمع هذه الأنسجة في أقل من ساعة بعد أن يبدأ القلب في النبض ، بغض النظر عن خبرة أو مستوى مهارة المستخدم. ويجري إعداد أدلة أكثر تقدما وتفصيلا لجمع العديد من الأنسجة الأخرى كأوراق مصاحبة منفصلة.

بالنسبة للمستخدمين الأقل خبرة ، يوصى دائما بتجربة هذا البروتوكول أولا على التي يتم قتلها رحيما لأسباب أخرى غير التجريب قبل أخذ عينات من أي يصعب استبدالها (مثل الجينات المحورة ، في سن متقدمة ، وما إلى ذلك). من الناحية المثالية ، ستكون جميع التي تم أخذ عينات منها صحية ، وإذا كانت أنثى ، فلن تكون قد تم التبويض في الأسبوعين الماضيين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب وفقا لقواعد وأنظمة كلية الطب بجامعة هارفارد IACUC (اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام) (IS 00001365_3). تم عرض النتائج التمثيلية لكل من ذكر ألبينو ناضج غير مثقوب وغير مثقوب Xenopus laevis.

1. التحضير التجريبي

ملاحظة: إذا تم اتباع بروتوكول التروية⁸ قبل أخذ العينات، فانتقل إلى الخطوة 2.2.

1. تأكد من أن المؤسسة البحثية قد وافقت على تقنية القتل الرحيم الموضحة في هذا البروتوكول.
2. تحضير محلول 5 غ/لتر MS-222 (تريكايين ميثان سلفونات) و5 غ/لتر بيكربونات الصوديوم (انظر جدول المواد). يجب أن يكون الحجم أكبر من الحجم المطلوب لتغطية التي يتم قتلها رحيما بالكامل. تحقق من الرقم الهيدروجيني للتأكد من أنه ≥7.
3. إجراء القتل الرحيم الأولي عن طريق وضع Xenopus في محلول القتل الرحيم ؛ سيبقى مغمورا لمدة 1 ساعة.
4. قم بإعداد محطة التشريح بحيث يمكن شطف جميع الأنسجة بعد أخذ العينات مباشرة في برنامج تلفزيوني مبرد أو 0.7x PBS⁹ (حسب الاحتياجات التجريبية) ، وفحصها ، وتقليمها تحت ضوء تكبير 5x (أو أكبر). يجب أن تمكن هذه المحطة المستخدم أيضا من استبدال جميع الملقط والمقص أو مسحها نظيفة بين الاستخدامات.
5. بمجرد أن يكون الضفدع في المحلول لمدة 1 ساعة ، يكون القتل الرحيم الأولي قد اكتمل. قم بإزالة الضفدع وتحقق من فقدان استجابة الألم عن طريق إجراء قرصة القدم.
6. سجل التفاصيل المناسبة للحيوان ، مثل الأنواع والسلالة والجنس والعمر والحالة الصحية وكذلك ما إذا كان معطرا. قم بوزن Xenopus وأخذ أي قياسات إضافية ، مثل طول فتحة الخطم.
7. ضع الضفدع على ظهره وثبت الأطراف القريبة من الجسم (الشكل 1).
8. باستخدام مقص التشريح ، قم بقطع الجلد ، حتى خط الوسط ، ثم بشكل جانبي ، مما يجعل اثنين من اللوحات.
9. بالرجوع إلى الشكل 2 ، حدد الخط العريض واستخدم الملقط للإمساك به وسحبه بعيدا عن التجويف القولوني. قطع من خلال العضلات بعناية باستخدام مقص. اصنع اثنين من اللوحات من جدار التجويف. قص أو دبوس جميع اللوحات بعيدا عن الطريق.
10. حدد القلب الذي سيظل ينبض. استخدم مقص التشريح لتقليل العظام الغرابية (الشكل 2) للوصول بشكل أفضل إلى القلب.
    ملاحظة: إذا توقف القلب عن النبض قبل أخذ العينات ، تجدر الإشارة إلى أن نضارة العينة قد تعرضت للخطر.

2. أخذ العينات

ملاحظة: إذا تم ترشيح ، فانتقل إلى الخطوة 2.2.

1. حدد التامور الرقيق واسحبه مشدودا بملقط الأنسجة (الشكل 3).
2. باستخدام طرف مقص استئصال القزحية ، قم بثقب التامور برفق ، مع الحرص على عدم قطع الأنسجة الكامنة. قشر التامور بعيدا عن 3 غرف من القلب.
3. استخدم الملقط للإمساك بالبطين من القمة ، وحدد مكان ارتباطه بالأذن والجذع الشرياني (الشكل 4) ، وقم بقصه أسفل هذه المرفقات (الشكل 5). إذا لزم الأمر ، قم بقص البطين بحيث لا تكون الأنسجة من الأذن أو الجذع الشرياني مرئية ، وسيظل نسيج الصمام ذو اللون الفاتح مرئيا داخل البطين.
   ملاحظة: في غير المفعمة بالحيوية ، قد تكون إزالة البطين بمثابة قتل رحيم ثانوي.
4. ستكون 3 فصوص من الكبد مرئية (الشكل 6 والشكل 7). أمسك شفة الفص الأيسر (على يمين المشاهد) وارفعها برفق بحيث تكون القنوات الكبدية والكيسية مرئية (الشكل 8). عينة من الجزء السفلي 1/3 من الفص أسفل هذه المرفقات (الشكل 9).
5. للوصول بشكل أفضل إلى أنسجة أنثى الضفدع ، من المفيد إزالة المبيض. حدد المبيض المغلف بطبقة من الصفاق الحشوي تسمى الظهارة الجرثومية. حرك الفصوص برفق حتى تصبح على جانبي كل منها لجعل منطقة التعلق مرئية (الشكل 10). هذه المرفقات بطنية مباشرة للكلية المقترنة.
6. باستخدام المقص ، قم بإزالة المبايض بالقرب من الكلى قدر الإمكان دون إتلافها (الشكل 11).
7. افحص الفص الإنسي (ويسمى أيضا الفص الأمامي) للكبد ولاحظ كيفية اتصاله بالمعدة والاثني عشر من خلال المساريق والقناة الكبدية (وتسمى أيضا القناة الصفراوية المشتركة) (الشكل 6 والشكل 7 والشكل 8).
8. قطع الرباط المساريقي والكبد الاثني عشر باستخدام مقص استئصال القزحية وكذلك القناة الكبدية حيث تلتقي بالاثني عشر. قطع اتصال البنكرياس والقناة الكبدية بالفص الإنسي للكبد بحيث لا يتم ربط أنسجة الكبد الداكنة (الشكل 12).
9. أمسك المعدة بالملقط المسنن والطرف العلوي للبنكرياس بملقط الأنسجة. تحت تكبير 5x ، ندف البنكرياس برفق من المعدة (الشكل 13).
   ملاحظة: إذا لم يتم التخلص منه بشكل نظيف ، فستكون أنسجة البنكرياس المتبقية مرئية ويمكن التقاطها في شظايا. بدلا من ذلك ، يمكن فصل البنكرياس بشكل منهجي باستخدام مقص استئصال القزحية وملقط الأنسجة.
10. بالإشارة إلى الشكل 14 أ ، حدد المثانة البولية وقم بإزالتها ، مع قطعها بالقرب من العباءة قدر الإمكان. تخلص من هذا المنديل.
11. بالرجوع إلى الشكل 14 ب، حدد الأمعاء الغليظة واسحبها مشدودة لقطع الأمعاء الغليظة بالقرب من العباءة قدر الإمكان. إزالة وتجاهل القناة الهضمية بأكملها ، وقطع الصفاق حيث تعلق على الطحال. سيتم الآن الوصول إلى الأجسام الدهنية بالكامل.
12. ندف بعيدا عن الأجسام الدهنية بحيث تكون على جانبيها. ستكون المنطقة فوق الكلى ، حيث يتصل الجسم الدهني بالصفاق ، مرئية. أمسك قاعدة الجسم الدهني الأيسر (على يمين المشاهد) واستخدم المقص لقطعه بعيدا عن الصفاق ، تاركا هامشا صغيرا حتى لا تتلف الكلى (الشكل 15).
13. إزالة وتجاهل الجسم الدهني المتبقي. ستكون الكلى المقترنة مرئية بالكامل الآن.
14. في إناث الضفادع أو الذكور ذات قنوات البيض الأثرية المميزة ، أمسك قناة البيض واسحبها بعيدا عن الكلى والعباءة (الشكل 16). قطع قناة البيض حيث تلتقي بالعباءة واستمر في سحبها بعيدا عن الكلى ، وقطع أي مرفقات بريتونية واضحة عندما تصبح واضحة. تخلص من هذا المنديل.
15. كرر هذه العملية مع قناة البيض المتبقية.
16. لا تزال الكلى مغطاة بالصفاق الصافي (خلف الصفاق)¹⁰. استخدم الملقط لفهم الكلى وقطع الصفاق في نهايتها السفلية.
17. ارفع الكلى من التجويف القولوني ، باستخدام مقص لقطع الصفاق بالقرب من الكلى قدر الإمكان دون إتلافها (الشكل 17).
18. تحت التكبير 5x ، قم بقطع الصفاق الزائد وأي أنسجة أخرى متبقية (الأجسام الدهنية والطحال). إذا كان الضفدع أنثى ، فتأكد من إزالة أي نسيج مبيض متبقي (الشكل 18). إذا كان الضفدع ذكرا ، فقم بإزالة الخصية بعناية وتحقق من وجود قناة بيض أثرية ، والتي قد لا تكون مرئية بدون تكبير (الشكل 19).
19. قم بإزالة الدبابيس من ، واقلبها على بطنه ، وأعد تثبيت أطراف.
20. حدد أيا من الطرفين الخلفيين لأخذ عينة منه وقم بتثبيت قدم هذا الطرف.
21. قم بإزالة رفرف جلدي على شكل لوز من فوق الساق / الشظية الظنبوبية (الشكل 20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من خلال استخدام الشكل 1 إلى الشكل 20 واتباع جميع خطوات هذا البروتوكول ، تم استئصال البطين القلبي والفص الأيسر من الكبد والبنكرياس والأجسام الدهنية اليسرى والكلى المقترنة وسديلة من الجلد بشكل نظيف في غضون ساعة من القتل الرحيم. خلال هذا الوقت ، يتم شطف العينا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نظرا لأن هذا البروتوكول يهدف إلى زيادة النضارة إلى أقصى حد ، فقد تتضمن بعض العينات أنسجة غير مرغوب فيها. على سبيل المثال ، يتم أخذ عينات من القناة الكبدية وبعض المساريق مع البنكرياس ، وسيتم دائما أخذ عينات من بعض الأنسجة البريتونية والغدد الكظرية والحالب مع الكلى المقترنة.  إذا لم تكن النض...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385