العزلة النووية من خلايا الدم المشتقة من المختبر المحفوظة بالتبريد

Summary

وصفنا بروتوكولا لاستخراج نوى عالية الجودة من أنواع الخلايا الجذعية اللحمية / البطانية وخلايا الدم المشتقة من الخلايا الجذعية المحفوظة بالتبريد لدعم تحليلات تسلسل الجيل التالي من النواة الواحدة. يعد إنتاج نوى سليمة عالية الجودة أمرا ضروريا لتجارب multiomics ولكن يمكن أن يكون عائقا أمام الدخول إلى الميدان لبعض المختبرات.

Abstract

تعد النماذج القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) منصات ممتازة لفهم نمو الدم ، وخلايا الدم المشتقة من iPSC لها فائدة متعدية ككواشف اختبار سريرية وعلاجات خلوية قابلة للنقل. إن ظهور وتوسيع تحليل multiomics ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النواة (snRNAseq) ومقايسة تسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة Transposase (snATACseq) ، يوفر إمكانية إحداث ثورة في فهمنا لتطور الخلايا. وهذا يشمل علم الأحياء التنموي باستخدام نماذج المكونة للدم في المختبر . ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تقنيا عزل النوى السليمة عن الخلايا المزروعة أو الأولية. غالبا ما تتطلب أنواع الخلايا المختلفة استعدادات نووية مخصصة اعتمادا على صلابة الخلايا ومحتواها. يمكن أن تحد هذه الصعوبات الفنية من جودة البيانات وتعمل كحاجز أمام الباحثين المهتمين بمتابعة دراسات multiomics. غالبا ما يكون حفظ العينات بالتبريد ضروريا بسبب القيود المفروضة على جمع الخلايا و / أو معالجتها ، ويمكن أن تشكل العينات المجمدة تحديات تقنية إضافية للعزل النووي السليم. في هذه المخطوطة ، نقدم طريقة مفصلة لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC في مراحل مختلفة من تطور المكونة للدم في المختبر لاستخدامها في سير عمل multiomics أحادي النواة. لقد ركزنا تطوير الطريقة على عزل النوى من الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة المشتقة من iPSC والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالهوية الهيكلية والخلوية. وقد حدت خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها الموصوفة من التكتل النووي والحطام، مما سمح باستعادة النوى بكميات ونوعية كافيتين للتحليلات النهائية. يمكن تكييف طرق مماثلة لعزل النوى عن أنواع الخلايا الأخرى المحفوظة بالتبريد.

Introduction

تكون الدم هو نظام تنموي جيد التوصيف نسبيا ، لكن عدم القدرة على تلخيص تكوين خلايا الدم في المختبر يدل على فهم غير مكتمل للعوامل ذات الصلة. يمكن أن تساعد نماذج تكون الدم القائمة على الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) في توضيح العوامل التنموية الرئيسية والبيولوجيا ذات الصلة. يقدم نظام iPSC أيضا نموذجا ممتازا لدراسة اضطرابات الدم ، وقد تم تطوير خلايا الدم القائمة على iPSC لإنتاج الكواشف ذات الصلة متعدية وعلاجية^1،2،3،4. تم استخدام دراسات الخلية الواحدة على نطاق واسع للتحقيق في علم الأحياء التنموي القائم على iPSC ، بما في ذلك أنواع الخلايا التي يتم إنتاجها أثناء تكون الدم⁵. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، والذي لا يمكنه استنتاج العلاقات بين المجموعات السكانية الفرعية^{للخلايا 6} ، تسمح طرائق الخلية الواحدة بتقييم عدم تجانس الخلية ويمكن أن تسهل تحديد وتوصيف تطور الخلية ^6,7.

يتطلب تكوين الخلايا المكونة للدم من iPSCs تمايزا متسلسلا من خلال الخط البدائي والأدوم المتوسط والحالات البطانية لتشكيل خلايا بطانية دموية. الخلايا البطانية الدموية هي سلائف مباشرة للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم⁸. هذه الأنواع من الخلايا لها خصائص مورفولوجية وخلوية مختلفة بشكل ملحوظ. هناك فهم محدود للمشهد اللاجيني والديناميكيات التنموية لنماذج الخلايا المكونة للدم المشتقة من المختبر ، على الرغم من أن هذه معرفة أساسية لإطلاق العنان للإمكانات العلاجية الكاملة لنظام iPSC. في كثير من الحالات ، تسمح طرق تحليل الخلية المفردة فقط بتحديد مجموعات الخلايا ، وأنشطة النسخ ، والمناظر الطبيعية للكروماتين ، والآليات التنظيمية التي تحكم التطور بين مستحضرات الخلايا غير المتجانسة.

يمكن أن تكشف منهجيتان ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNAseq) وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي النوى (snRNAseq) ، عن رؤى نسخية على مستوى الخلية^{الفردية 9}. أحد العوامل الرئيسية التي تملي صحة البيانات وموثوقيتها هو الحاجة التي لا هوادة فيها للعينات التي تلبي معايير الجودة الصارمة. وتشمل هذه المتطلبات الدقيقة للخلية / الكثافة النووية ، والجدوى المثلى ، والحد الأدنى من التكتل. يمكن أن يكون تحضير النوى المفردة أمرا صعبا من الناحية الفنية. يمكن أن تكون هناك تحديات إضافية مرتبطة باستخدام الخلايا المحفوظة مسبقا بالتبريد.

نلاحظ أربعة قيود محتملة مهمة على نهج scRNAseq القياسية. أولا ، غالبا ما تشير البروتوكولات القياسية لتوليد معلقات الخلايا إلى المستحضرات من الخلايا أو الأنسجة الطازجة ، بدلا من تلك التي يتم استردادها بعد الحفظ بالتبريد¹⁰. هذا يمكن أن يحد من فائدة الموارد التي يحتمل أن تكون قيمة. ثانيا ، كفاءة التفكك لأنواع الخلايا المختلفة متغيرة. على سبيل المثال ، تخضع العديد من أنواع الخلايا المناعية للتفكك بسهولة نسبية. في المقابل ، فإن الخلايا اللحمية والخلايا الليفية والخلايا البطانية ، والتي عادة ما تكون مضمنة في المصفوفة خارج الخلية والغشاء القاعدي ، لها خصائص خلوية فريدة يمكن أن تعقد عزل النوى^11,12. يمكن أن تتطلب هذه الخصائص بروتوكولات تفكك عدوانية ، والتي قد تعرض للخطر السلامة الهيكلية لمجموعات الخلايا الأكثر حساسية. ثالثا ، يمكن لبعض الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا النواة) أن يتجاوز قطرها 100 ميكرومتر وتشكل صعوبات للعديد من المنصات التجارية أحادية الخلية^{القائمة 13}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يؤدي التعامل غير السليم إلى تلف الخلايا واستجابات الإجهاد أثناء الخطوات الأولية لعزل الخلايا ، بما في ذلك التحلل المائي الأنزيمي والتفكك الميكانيكي ، مما قد يؤثر على ملفات تعريف التعبير الجيني^11,14.

لهذه الأسباب وغيرها ، قد يكون نهج النواة الواحدة بديلا مفضلا لطرق الخلية^{المفردة 15}. نظرا للاستقرار الفائق للغشاء النووي مقارنة بغشاء الخلية ، قد يظل الغلاف النووي سليما حتى بعد حفظ الأنسجة^{بالتبريد 16}. ومن شأن ذلك أن ييسر الاستخراج النووي ويعزز تنوع أنواع العينات المناسبة لطرائق تسلسل الجيل التالي. ثانيا ، تظهر النوى مقاومة عالية للاضطرابات الميكانيكية وتميل إلى إظهار تحولات نسخ أقل أثناء التفكك¹⁴. لذلك ، يمكن أن توفر النوى استقرارا أكبر للحمض النووي الريبي (RNA) وملفات تعريف نسخ أكثر قابلية للتكرار. الميزة الثالثة الجديرة بالملاحظة لطرق النوى المفردة هي عدم وجود قيود على حجم الخلية وإمكانية التطبيق على الخلايا الأكبر ، مثل خلايا عضلة القلب أو خلايا النواة¹². رابعا ، تعمل النوى كركائز مناسبة لتحليلات multiomics ، والتي تقدم رؤى موسعة من التحليل المتكامل للتعبير الجيني ، ومناطق الكروماتين التي يمكن الوصول إليها ، وغيرها من المعلمات¹⁷ ، مما يتيح فهما أعمق لعدم تجانس الخلايا وتطورها وحالاتها الوظيفية¹⁸.

من خلال التنميط iPSCs أثناء تطور المكونة للدم ، يمكن أن تساعد مناهج multiomics في تحديد العمليات التنموية في نماذج الأمراض العادية أو المرضية. يمكن أن توفر مقارنات الخلايا المشتقة من iPSC بالخلايا أو الأنسجة الأولية أيضا تقييما لإخلاص نموذج iPSC لبيولوجيا الجسم الحي ، مما يسهل تحسين نموذج iPSC واكتشاف مجموعات الخلايا الجديدة والعوامل التي تدفع تكوين الدم.

على الرغم من أن العديد من المجموعات قد نجحت في اجتياز العزل النووي وما نتج عنه من تحليل تسلسل الجيل التالي ، إلا أن عزل النوى عالية الجودة لا يزال يشكل عائقا أمام بعض المختبرات المهتمة بإجراء التحليلات القائمة على النواة المفردة. تفصل هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل النوى عالية الجودة من الخلايا المشتقة من iPSC المحفوظة مسبقا بالتبريد. لقد ركزنا على الخلايا اللحمية / البطانية الملتصقة والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة ، حيث تمثل هذه أنواعا مختلفة جدا من الخلايا فيما يتعلق بالبنية والمحتوى التي تتطلب تعديلات مخصصة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة استعادة النوى عالية الجودة القابلة للتسلسل من الجيل التالي أو تجارب أخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. الحفظ بالتبريد للخلايا

1. قم بتجميد >1 × 10⁶ خلايا معزولة مشتقة من iPSC لكل مل في 1 مل من 90٪ FBS و 10٪ DMSO. ضع المبردات في وعاء تجميد عند -80 درجة مئوية لتقليل سرعة التجميد وتحسين استعادة الخلايا القابلة للحياة (جدول المواد). توقع فقدان كبير للخلايا ، والذي يمكن أن يختلف بناء على ظروف الثقافة وهوية الخلية.
2. الانتقال من -80 درجة مئوية إلى تخزين النيتروجين السائل في غضون 24 ساعة.

2. ذوبان الخلايا

1. استرجع التبريد من تخزين النيتروجين السائل وقم بإذابة الجليد في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. أخرجه من الحمام المائي بينما لا تزال بلورات الثلج الصغيرة مرئية.
2. انقل الخلايا من cryovial إلى أنبوب فارغ سعة 15 مل وأضف ببطء 10 مل من الوسط المسخن مسبقا (RPMI 1640 + 10٪ FBS) أثناء الخلط بعناية. أجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية.
3. نضح المادة الطافية وإعادة تكوينها في 1 مل من DPBS المكمل ب 2٪ FBS و 1 mM CaCl₂ (جدول المواد). امزج بعناية عن طريق سحب 3x باستخدام ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر. نقل إلى أنبوب البوليسترين القاع المستدير 5 مل.

3. إزالة الخلايا الميتة

1. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل إزالة الخلايا الميتة (جدول المواد) إلى 1 مل من تعليق الخلية. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل اختيار البيوتين إلى خليط الخلية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. تقوم هذه الخطوات بتسمية الخلايا الميتة Annexin V ⁺ الموجودة داخل تعليق الخلية بالبيوتين.
2. دوامة قوية لمدة 30 ثانية ، حبات ديكستران مصممة لاستنفاد أنواع الخلايا غير المرغوب فيها المسمى بالبيوتين (جدول المواد). أضف 100 ميكرولتر من حبات ديكستران إلى تعليق الخلية واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل 2x باستخدام ماصة ميكرو 1000 ميكرولتر (جدول المواد).
3. أضف 1.3 مل من DPBS تحتوي على 2٪ FBS و 1 mM CaCl₂ إلى تعليق الخلية واخلطها عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل 2x باستخدام ماصة دقيقة 1000 ميكرولتر. ضع الأنبوب في المغناطيس (جدول المواد) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
4. اقلب المغناطيس والأنبوب لصب معلق الخلية الحية المخصب في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة معظم المادة الطافية وأعد تعليقها في 1 مل من DPBS + 0.04٪ BSA. امزجه برفق عن طريق سحب 3 مرات باستخدام ماصة صغيرة سعة 1000 ميكرولتر.

4. عزل النوى

1. تعليق الخلية الحية للطرد المركزي عند 460 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ثم نضح المادة الطافية ، مما يضمن عدم تعطيل حبيبات الخلية.
2. أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل الطازج 0.5x المبرد على الثلج (الجدول 1) واخلطه برفق عن طريق سحب 10x باستخدام ماصة صغيرة 100 ميكرو. احتضان 3 دقائق على الجليد.
3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المبرد (الجدول 2) إلى الأنبوب دون خلط. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

5. غسل وتقييم النوى

1. نضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل المبرد لإذابة الحبيبات السليمة المتبقية دون خلط. جهاز طرد مركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة جميع المواد الطافية دون تعطيل حبيبات النوى.
2. أعد التعليق في 120 ميكرولتر من المحلول المؤقت للنوى المخففة المبردة (الجدول 3). قم بتصفية تعليق الخلية باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر (جدول المواد).
3. صبغ مع 0.4 ٪ تريبان الأزرق وتقييم بصريا نوعية النوى المعزولة تحت المجهر 10x (جدول المواد).

6. معالجة النوى المعزولة

1. الحفاظ على النوى على الجليد. انتقل إلى مزيد من المعالجة على الفور ، حيث يمكن أن يحدث التكتل النووي بمرور الوقت ويستلزم خطوات ترشيح إضافية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لقد استخدمنا البروتوكول المذكور أعلاه لاستخراج النوى من الخلايا اللحمية / البطانية المشتقة من iPSC المحفوظة بالتبريد والخلايا السلفية المكونة للدم غير الملتصقة (العائمة). يمكن العثور على تمثيل تخطيطي مفصل لإجراء العزل النووي في الشكل 1.

للفحص المورفولوجي ، ت?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول
يعد عزل النوى عالية الجودة أمرا ضروريا للتنفيذ الناجح لطرائق تسلسل الجيل التالي الحالية القائمة على النواة المفردة ، والتي تتطور بسرعة. واعترافا بالحواجز القائمة أمام المختبرات المهتمة بهذه الأساليب، وخاصة بالنسبة للعينات المحفوظة بالتبريد، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3