* These authors contributed equally
يصف البروتوكول منصة الموائع الدقيقة المتقدمة لقياس ديناميكيات إفراز السيتوكين لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية الفردية. تقيس المنصة ما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات بالتوازي (IL-6 و TNFα و IL-1β) لكل خلية فردية يتم تحفيزها باستخدام عديد السكاريد الدهني كمثال.
يمكن أن تؤدي العدوى وأمراض المناعة الذاتية والاستجابات المناعية المرغوبة والسلبية للعلاج إلى استجابة معقدة وديناميكية للسيتوكين في الجسم الحي. تتضمن هذه الاستجابة العديد من الخلايا المناعية التي تفرز العديد من السيتوكينات لتنظيم التفاعل المناعي. ومع ذلك ، فإن ديناميكيات الإفراز والكميات والحدوث المشترك للسيتوكينات المختلفة حسب الأنواع الفرعية المختلفة للخلايا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد بسبب نقص الأدوات المناسبة لدراستها. هنا ، نصف بروتوكولا باستخدام منصة قطرات الموائع الدقيقة التي تسمح بالقياس الكمي الذي تم حله زمنيا لديناميكيات الإفراز للعديد من السيتوكينات بالتوازي على مستوى الخلية الواحدة. يتم تمكين ذلك من خلال تغليف الخلايا الفردية في قطرات الموائع الدقيقة جنبا إلى جنب مع مقايسة مناعية متعددة الإرسال للقياس الكمي المتوازي لتركيزات السيتوكين ، وتجميدها للتصوير الفلوري الديناميكي ، وتحليل الصور المعنية لاشتقاق الكميات والديناميكيات المفرزة. يصف البروتوكول تحضير الجسيمات النانوية المغناطيسية الوظيفية ، وتجارب المعايرة ، وإعداد الخلايا ، وتغليف الخلايا والجسيمات النانوية في قطرات للتصوير الفلوري وتحليل الصور والبيانات اللاحقة باستخدام مثال خلايا الدم البشرية أحادية النواة المحفزة عديد السكاريد الشحمي. حددت المنصة المقدمة سلوك إفراز السيتوكين المتميز للخلايا المفردة والمشتركة ، مما يميز عدم التجانس الظاهري المتوقع في عينة الخلية المقاسة. علاوة على ذلك ، تسمح الطبيعة المعيارية للفحص بتكييفه وتطبيقه لدراسة مجموعة متنوعة من البروتينات والسيتوكينات وعينات الخلايا ، مما قد يؤدي إلى فهم أعمق للتفاعل بين أنواع الخلايا المناعية المختلفة ودور السيتوكينات المختلفة التي تفرز ديناميكيا لتشكيل الاستجابة المناعية المنظمة بإحكام. يمكن أن تكون هذه الأفكار الجديدة مثيرة للاهتمام بشكل خاص في دراسات عدم التنظيم المناعي أو في تحديد السكان المستهدفين في العلاج وتطوير الأدوية.
غالبا ما تسبب العدوى تفاعلات مضيفة معقدة تشمل جهاز المناعة الفطري والتكيفي 1,2. عند الإصابة أو التعرف على العوامل المعدية ، يمكن للخلايا المضيفة إنتاج مجموعة متنوعة من الكيماويات والسيتوكينات ، وهي بروتينات صغيرة تعرف باسم الاتصالات الحرجة وتعديل الجهاز المناعي3. يتم إطلاق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات في وقت مبكر من الإصابة لبدء الاستجابة المناعية ، تليها لاحقا السيتوكينات المضادة للالتهابات ، والتي تعتبر ضرورية لمنع تلف الأنسجة والأمراض المزمنة أو الالتهابية الذاتية اللاحقة. يتجلى هذا التوازن بين القضاء على التهديد وحماية الأنسجة كذخيرة واسعة من السيتوكينات التي تمارس وظائف مختلفة أثناء العدوى ، مما يسمح بضبط الاستجابة 4,5. داخل هذا الخليط، يمكن ملاحظة التوقيعات الفريدة اعتمادا على مسبب المرض والإشارات التي يحفزها، وموقع الأنسجة، والخلايا المناعية التي تنشأ منها. ومع ذلك ، يبدو أن إطلاق السيتوكين يشكل أيضا عملية بيولوجية متعددة الوظائف فريدة من نوعها لكل مجموعة من الخلايا ، ومتنوعة في ديناميكيات الإفراز والاستجابة الفردية. تم وصف عدم التجانس هذا في الأدبيات لسنوات عديدة ، على سبيل المثال ، بين المجموعات السكانية الفرعيةللخلايا التائية 6,7 ، حيث أظهرت التحقيقات في الأمراض الالتهابية الذاتية والتهابات COVID-19 الشديدة تنوعا وظيفيا كبيرا لعلامات الالتهاب داخل وبين المرضى 8,9. في الآونة الأخيرة ، سلط ظهور تسلسل الخلية الواحدة الضوء على اللدونة العالية والحديث المتبادل بين المجموعات السكانية الفرعية داخل البيئات الدقيقة المناعية التي لم تكن واضحة من قبل ، مما يشير إلى أن طرق الخلية الواحدة ضرورية لالتقاط هذا عدم التجانس10,11. بينما يتم تطوير طرق جديدة لتحليل النسخ ، لا يزال تحليل النمط الظاهري يمثل تحديا ، لأن هذا يتطلب قياسات متزامنة وكمية وزمنية لإفراز البروتين على مستوى خلية واحدة. تسمح لنا هذه القياسات بالتحقيق في هويات الخلايا المفرزة وديناميكياتها وأنماط الإفراز (بطيئة / سريعة ، مبكرة / متأخرة ، متزامنة / متسلسلة) لذخيرة أو لوحة من السيتوكينات. من خلال تمكين دراسة ديناميكيات إطلاق السيتوكين أثناء الاستجابة المناعية كميا وبدقة زمنية ، قد تسمح الأفكار الناتجة بفهم المجموعة الخلوية والاستجابة المستحثة.
في البروتوكولات القياسية ، عادة ما يتم الكشف عن السيتوكينات في طاف معلقات الخلايا والمصل باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، مما ينتج عنه كميات مفرزة بكميات كبيرة. لا تسمح القياسات السائبة بالقياس الكمي لكميات السيتوكين التي تنتجها كل خلية ، وهي مشكلة تم تسليط الضوء عليها بشكل خاص في عينات الخلايا غير المتجانسة. تكتشف الطرق البديلة مثل تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا أو مقايسة البقعة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISpot) أو المقايسات المحفورة الدقيقة (على سبيل المثال ، Isoplexis) السيتوكينات التي تعبر عنها الخلايا الفردية ولكنها توفر قياسات نقطة النهاية فقط12,13. هذا يعني تجاهل ديناميكيات الإفراز والتغيرات التي قد تحدث في نمط الإفراز الخلوي خلال فترة الحضانة. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن لقياسات نقطة النهاية التمييز بين إفراز السيتوكين المتزامن والمتسلسل ، لذلك يظل المدى الحقيقي لتعدد الوظائف المتزامنة للخلايا المناعية في إفراز السيتوكين غير واضح باستخدام هذه الطرق.
يمكن تحقيق دقة الخلية الواحدة باستخدام الموائع الدقيقة القطيرية لتوليد ومعالجة مقصورات مادية بحجم بيكولتر من أجل دراسة الخلايا المناعية على الأنماط الظاهرية الفريدة لإفراز السيتوكين على مستوى الخليةالواحدة 14,15. تتكون هذه المقصورات من مستحلبات الماء في الزيت ويمكن توليدها باستخدام رقائق الموائع الدقيقة16,17. في الواقع ، أظهرت مقايسات الموائع الدقيقة القائمة على القطيرات تنوعا شديدا في تمكين تحليل العينات والذخيرة البيولوجية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة وتكاملها مع المنبع (معالجة الخلايا والكواشف) وعمليات المصب (فرز الخلية الواحدة أو البروتينات أو التسلسل)18،19،20،21،22. على وجه الخصوص ، تسمح الإعدادات التي تسمح بتثبيت القطيرات بقياس وظيفة الخلية الواحدة بمرور الوقت ، وهو أمر مهم لتحليل إفراز البروتين18. علاوة على ذلك ، فإن دمج المقايسات الكمية متعددة الإرسال يسهل إجراء تحقيقات إضافية في أبعاد لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقا ، في عمليات مثل الإفراز المشترك وتحديد الخلايا المناعية متعددة الوظائف23,24.
في هذا البروتوكول ، نصف سير عمل أحادي الخلية قائم على القطيرات الثابتة لاكتشاف وقياس وقياس إفراز ما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات بالتوازي من الخلايا الفردية17,23. توفر هذه التقنية القدرة على مراقبة استجابات السيتوكين من أكثر من 20000 خلية بالتوازي.
يتكون سير العمل المقدم من تغليف الموائع الدقيقة للخلايا المناعية المفردة والجسيمات النانوية الوظيفية في قطرات ماء في زيت 60 pL. يسمح تجميد >100000 قطرة في غرفة المراقبة والفحص المجهري الفلوري الذي تم حله بمرور الوقت بقياس ديناميكيات إفراز السيتوكين داخل كل قطرة وكل سيتوكين (الشكل 1 أ). لكل خلية فردية داخل قطرة ، يتم قياس إفراز السيتوكين بواسطة مقايسة مناعية شطيرة ، حيث تربط الجسيمات النانوية المغناطيسية التي تعمل بجسم مضاد التقاط محدد السيتوكين المفرز ، مما يؤدي إلى النقل اللاحق وربط الأجسام المضادة للكشف الموسومة بالفلورسنت (الشكل 1B ، C). يتم تشكيل خط الخرز عن طريق محاذاة الجسيمات النانوية المغناطيسية ، والتي يمكن تحديد انتقال التألق إليها في وجود السيتوكين. هنا ، يتم تعريف نقل التألق على أنه متوسط شدة التألق الموجود على خط الخرز مقسوما على متوسط شدة التألق للقطرة المتبقية. يمكن مضاعفة هذا الفحص للعديد من السيتوكينات عن طريق خلط دفعات الجسيمات النانوية ذات الوظائف المختلفة والأجسام المضادة للكشف ذات الصلة الموسومة في قنوات مضان مختلفة23 ، مما يؤدي إلى عمليات نقل مضان محددة في القنوات المختلفة. بمساعدة برنامج نصي مخصص للتحليل ، يمكن استخراج قيم نقل التألق ، ويمكن تحويل الصور إلى ملفات تعريف ديناميكية إفرازية لكل خلية فردية وسيتوكين. لذلك ، فإن مجموعات البيانات الناتجة تنتج العديد من القراءات ، مثل قياس الإفراز الكمي بمرور الوقت ، وتحديد المجموعات السكانية الفرعية المشتركة ، وتوزيعات الخلايا وفقا للكميات المفرزة ، والمعدلات ، ومجموعات السيتوكينات.
الشكل 1: سير العمل ومبدأ الفحص. أ: نظرة عامة على سير العمل لتحليل الخلايا المفرزة للسيتوكينات بعد التحفيز. يتم تحضير معلقات أحادية الخلية وجسيمات نانوية مغناطيسية وتغليفها في 60 مل في مستحلبات الزيت / الماء الحجمية (قطرات). يتم تثبيت القطرات ومحاذاة الجسيمات النانوية داخل مجال مغناطيسي قبل القياس لمدة تصل إلى 4 ساعات كل 30 دقيقة. أخيرا ، يتم تحليل الصور ، ويتم استخراج المعلمات لكل قطرة ونقطة زمنية وقناة فلورسنت. وقد عدل هذا الرقم من17. (ب) مبدأ المقايسة الحيوية لشطيرة القطيرات. تربط الجسيمات النانوية الوظيفية السيتوكينات المفرزة ، مما يؤدي إلى النقل اللاحق للأجسام المضادة للكشف ذات العلامات الفلورية إلى الجسيمات النانوية. يتم تحديد هذا النقل للتألق والتحقق من صحته من خلال تجارب المعايرة التي أجريت باستخدام السيتوكينات المؤتلفة. يسمح خلط الجسيمات النانوية الوظيفية المختلفة بإجراء قياسات متعددة لما يصل إلى ثلاثة سيتوكينات في وقت واحد. (ج) في التجارب القائمة على الخلايا، تتبع القطرات خلال زمن القياس، ويتم تحديد الخلايا المفرزة من خلال زيادة الوقت الإضافي في انتقال التألق إلى الجسيمات النانوية. المخططات ليست على نطاق واسع. تم إنشاء الشكل باستخدام BioRender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إجراء جميع التجارب بموجب اتفاقية الأخلاقيات EK202-N-56 ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في ETH Zurich. تم إجراء مناولة الخلايا البشرية في خزانة تدفق رقائقي موجودة في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2.
ملاحظة: توضح الأقسام التالية بالتفصيل بروتوكول قياس إفراز السيتوكين الذي تم حله زمنيا على مستوى خلية واحدة. يتم تطبيق الإجراء الموضح هنا على تحفيز خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC) باستخدام عديد السكاريد الدهني (LPS) والقياس المتوازي للسيتوكينات IL-6 و TNFα و IL-1β. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن تكييف البروتوكول مع أنواع الخلايا والمنشطات والسيتوكينات الأخرى.
1. تصنيع غرفة المراقبة
ملاحظة: لتجنب حركة القطرات أثناء التصوير ، يتم تحضير غرفة مراقبة بارتفاع أصغر بحوالي 10٪ من قطر القطرة.
2. وظيفية الجسيمات النانوية
ملاحظة: تتشابه عملية وظيفة الجسيمات النانوية لكل سيتوكين ، والفرق الوحيد هو إضافة الأجسام المضادة الخاصة بالسيتوكين. يتم تنفيذ الوظائف لكل سيتوكين في أنابيب تفاعل فردية مختلفة بالتوازي. قبل هذا البروتوكول ، تم تصنيف الجسم المضاد لالتقاط TNFα والجسم المضاد للكشف IL-1β داخليا مع البيوتين و Alexa Fluor 647 ، على التوالي. تم إجراء الاقتران وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة الموجود على موقع البائع (انظر الروابط في جدول المواد) وتم نقل الأجسام المضادة وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
3. إعداد الخلية
ملاحظة: تم عزل PBMC من معطف بافي تم استلامه من بنك الدم في زيورخ. تم تجميد الخلايا وتخزينها في cryovials (1 × 107 خلايا / قارورة) في النيتروجين السائل لعدة أشهر.
4. التغليف وإنتاج القطيرات
ملاحظة: يتم تمكين تغليف الخلايا في قطرات بواسطة شريحة مولد قطرات الموائع الدقيقة ، والتي يتم وصف تصنيعها بتفصيل كبير في مكان آخر17. البدائل متاحة تجاريا (انظر المثال في جدول المواد). يحتوي تصميم رقاقة مولد القطيرات المناسب على مدخلين للمراحل المائية ، ومدخل واحد لمرحلة الزيت ، ومخرج واحد للقطرات المتولدة. علاوة على ذلك ، يجب أن تمكن رقاقة مولد القطيرات التجارية المناسبة من إنتاج الماء في قطرات الزيت المفلورة بحجم 40-60 pL. ينتج عن البروتوكول الموصوف هنا مستحلبات ماء / زيت (قطرات) بقطر 50 ميكرومتر. يمكن أن يؤدي استخدام خيارات مختلفة لتغيير البروتوكول إلى قطرات أكبر أو أصغر.
الشكل 2: نظرة عامة على إعداد الموائع الدقيقة. (أ) إعداد تغليف القطيرات باستخدام مضخة المحقنة ، ورقاقة توليد القطيرات ، وغرفة المراقبة وحامل المجهر. (B) صورة لقابس PDMS المثقوب (أعلى) لتشكيل موصل بطرف ماصة 200 ميكرولتر (أسفل) ، كما هو موضح في خطوة البروتوكول 4.1.2. (ج) صور لتوصيل أطراف الأنابيب والماصة بشريحة توليد القطيرات. (د) صورة للغرفة الموضوعة داخل حامل المجهر المطبوع 3D المخصص مع مغناطيسين في الأعلى والأسفل. (ه) صورة لغرفة المراقبة (مع شريط أبيض للتوضيح). (F) تخطيط رقاقة الموائع الدقيقة لإنشاء القطيرات (شريط المقياس: 750 ميكرومتر). وقد عدل هذا الرقم من17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. الحصول على الصور وقياسها
ملاحظة: يتم الحصول على الصور على مجهر مضان مقلوب قياسي محاط بحاضنة ، مما يسمح بإجراء قياسات عند 37 درجة مئوية. الإعدادات الموصوفة هنا خاصة بمجهر Nikon Eclipse Ti2 الذي يعمل ببرنامج NIS Elements (V. 5.30.04) المجهز بكاميرا Orca Fusion ولكنها قابلة للتكيف بشكل عام مع أي مجاهر وكاميرات مضان أخرى.
6. تحليل الصور
الشكل 3: تحليل الصور الذي يقوم به برنامج تحليل الصور. (أ) يتم الكشف عن القطرات في قناة برايت فيلد (BF) باستخدام تحويل Hough ، مع تمييز كل قطرة بدائرة حمراء. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. (ب) داخل كل قطرة ، يتم تحديد حبة الجسيمات النانوية من خلال ألمع وحدات البكسل في المستوى الأفقي ومتوسط شدة التألق لجميع وحدات البكسل الممتدة من أعلى القطرة إلى أسفلها. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد الخلية من خلال نسبة البكسل >0 أعلى من الحد لمنطقة القطرة بأكملها. شريط المقياس: 20 ميكرومتر. (ج) يقارن برنامج المحلل شدة التألق على الجسيمات النانوية بخلفية القطيرات لقنوات FITC و TRITC و Cy5 على جميع النقاط الزمنية المقاسة لكل قطرة فردية. تظهر النقاط الزمنية 0 و4 (120 دقيقة) و9 (240 دقيقة). للتحقق يدويا من اكتشاف القطيرات والخلايا بشكل صحيح ، يتم عرض قنوات DAPI و BF أيضا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
7. المعايرة
ملاحظة: للحصول على قراءة كمية ، يجب إجراء معايرة تركيزات السيتوكين لقيم نقل التألق مرة واحدة ، حيث يمكن أن تحدث اختلافات بين الإعدادات التجريبية المختلفة. يتم تفصيل جميع الخطوات المطلوبة في أقسام البروتوكول السابقة كما هو مشار إليه.
8. تحليل البيانات
سمحت المنصة الوظيفية أحادية الخلية المقدمة بقياس العديد من المعلمات. أولا ، وعلى غرار التقنيات القياسية ، يتم تصوير تواتر الخلايا المفرزة في نهاية القياس (الشكل 4 أ). بعد التحفيز باستخدام 1 ميكروغرام / مل من عديد السكاريد الدهني (LPS) لمدة 6 ساعات من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMC) ، 5.81٪ من الخلايا تفرز IL-6 (ن = 1270) ، 4.55٪ TNFα (ن = 995) و 6.06٪ IL-1β (ن = 1326).
لتحديد إفراز السيتوكين ، تم إنشاء منحنيات معايرة بتركيزات معروفة من السيتوكينات المؤتلفة (الشكل 4 ب). تسمح منحنيات المعايرة هذه بالقياس الكمي لتركيزات السيتوكين داخل القطيرات بمرور الوقت. على سبيل المثال ، وصل متوسط تركيز IL-6 في القطرة إلى هضبة بعد 90 دقيقة ل PBMC المحفز LPS ، في حين زاد متوسط IL-1β داخل القطرة بسرعة أكبر من 90 دقيقة ، مما يعرض الدقة الديناميكية للمنصة وإمكانية استخراج مجموعات فرعية من الخلايا تفرز سيتوكينات معينة (الشكل 4C). مع تغير التركيز بين نقاط القياس ، يمكن حساب معدلات الإفراز الديناميكية لكل سيتوكين. بالنظر إلى متوسط معدل الإفراز لكل سيتوكين (الشكل 4 د) ، أظهرت الخلايا المفرزة IL-6 انخفاضا ثابتا في متوسط معدل الإفراز ، بينما أظهرت كل من الخلايا المفرزة TNFα و IL-1β زيادة في معدل الإفراز بعد 90 دقيقة من وقت القياس وانخفاض ثان بعد 150 دقيقة.
علاوة على ذلك ، من الممكن تجميع الخلايا في مجموعات فرعية اعتمادا على السيتوكينات المفرزة والمفرزة (الشكل 4E). هنا ، يتم إفراز IL-6 و TNFα بشكل فردي بنسبة 30.2٪ و 26.4٪ من الخلايا التي تفرز IL-6 أو TNFα ، على التوالي ، بينما تشكل خلايا IL-1β أحادية الإفراز 68.8٪ من جميع الخلايا المفرزة IL-1β. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن حل آثار الإفراز المشترك على التركيزات المفرزة ومعدلات الإفراز (الشكل 4F). من خلال النظر إلى الخلايا التي تفرز IL-6 ، تم إفراز كميات مختلفة من IL-6 إذا أنتجت الخلايا بالإضافة إلى TNFα أو IL-1β. وبالمثل ، اختلف توزيع متوسط معدلات الإفراز على القياس إحصائيا بين الخلايا التي تفرز IL-6 أو IL-6 فقط جنبا إلى جنب مع TNFα (معدلات إفراز أعلى) و IL-1β (معدلات إفراز IL-6 أقل).
الشكل 4: النتائج التمثيلية لإفراز IL-6 و TNFα و IL-1β PBMC بعد تحفيز لمدة 6 ساعات باستخدام 1 ميكروغرام / مل LPS. (أ) النسبة المئوية لإفراز PBMC IL-6 و TNFα و IL-1β في نهاية القياس لمدة 4 ساعات. (ب) تتولد منحنيات معايرة السيتوكينات المتعددة بتركيزات معروفة من السيتوكينات المعاد الاتحاد. وهذا يسمح بالقياس الكمي لتجارب الخلية عن طريق الحوسبة من قيمة النقل تركيز السيتوكين داخل القطرة. تم تركيب النقاط باستخدام ملاءمة منحنى ارتباط أحادي الطور غير خطي ، r2 = 0.9926 (IL-6) ، 0.9901 (TNFα) ، 0.9990 (IL-1β). (ج) متوسط التركيزات المفرزة من IL-6 و TNFα و IL-1β المنبعثة عن طريق إفراز PBMC خلال وقت القياس 4 ساعات. (د) متوسط معدلات إفراز IL-6 و TNFα و IL-1β خلال وقت القياس 4 ساعات. ه: النسبة المئوية النسبية لخلايا الإفراز المشترك التي تفرز IL-6 أو TNFα أو IL-1β وتوليفاتها. تطبيع لجميع الخلايا المفرزة المكتشفة لكل سيتوكين. (F) متوسط تركيزات IL-6 خلال وقت القياس ومتوسط توزيعات معدل الإفراز (اللوغاريتم) للخلايا المفرزة IL-6 ذات استبانة الإفراز المشترك (ن = 383 ل IL-6 فقط ، ن = 531 ل IL-6 + TNFα ، ن = 213 ل IL-6 + IL-1β و ن = 143 ل IL-6 + TNFα + IL-1β). تم تقييم الاختلافات الإحصائية في توزيعات معدل الإفراز باستخدام اختبارات Kolmogorov-Smirnov ذات الوجهين ، غير المتزاوجة ، غير المعلمية بثقة 95٪ ، ويتم تمثيل القيمة الاحتمالية. ** (ص <0.002) و **** (ص <0.0001). يمثل الخط الكامل الوسيط والخط المنقط الأرباع. nمجموع الخلايا = 21 866. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لاستخراج معلومات إضافية عن مستوى الخلية الواحدة ، يمكن تركيب وظيفة السيني على نقاط تركيز الوقت لكل خلية وسيتوكين (الشكل 5). تم تصوير تركيز مثالي بمرور الوقت لمجموعة بيانات لخلية واحدة والملاءمة السينية المقابلة في الشكل 5A. هنا ، ينتج عن إجراء تركيب المربعات الصغرى المعلمات التالية: C ، المقابلة لقيمة الهضبة العليا للمنحنى ، t50 تحديد التحول الزمني للمنحنى من الصفر ، ومنحدر Hill m ، الذي يصف انحدار الجزء الصاعد من منحنى السيني مع قيم تركيز 10٪ و 90٪ تم الوصول إليها طوال القياس. من معلمات الملاءمة هذه ، يمكن استخراج بعض واصفات المنحنى كما هو موضح في الخطوة 7.12. ينتج Cmax ، أعلى قيمة تركيز للبيانات ،t start ، وقت بدء الإفراز ، الذي يعرف بأنه الوصول إلى 10٪ من قيمة تركيز الهضبة العليا ، و SRlin ، معدل الإفراز خلال الجزء الصاعد من المنحنى.
لتصنيف المجموعات السكانية الفرعية للخلايا ، تم تصنيف واصفات المنحنى التي تم الحصول عليها من جميع نوبات الخلية المفردة إلى ثلاث فئات لكل منها: تم تجميع قيمC القصوى في منخفضة ومتوسطة وعاليةلتبدأ t في وقت مبكر ومتوسط ومتأخر منخط SR إلى إفرازات بطيئة ومتوسطة وسريعة. لتوضيح هذا التصنيف ، يتم عرض أربعة منحنيات إفراز أحادية الخلية نموذجية وواصفات المنحنى المقابلة لها (الشكل 5A-D) ، حيث يعرض المنحنى A خصائص إفراز منخفض مبكر بمعدل متوسط ، والمنحنى B هو إفراز مبكر وبطيء ومرتفع ، والمنحنى C إفرازا مرتفعا سريعا مبكرا ، ويظهر المنحنى D إفرازا منخفضا متأخرا. من المهم ملاحظة أن القطع لهذه المعايير هي خاصة بالخلية والسيتوكين ومعلمة الفحص ، وتحتاج إلى تكييفها لكل سؤال بحثي. علاوة على ذلك ، تم النظر هنا فقط في إفراز IL-6 ل PBMC بعد تحفيز 1 ميكروغرام / مل LPS لمدة 6 ساعات ، مما يعني أن معظم الخلايا كانت إفرازات مبكرة وعالية بنسبة 80٪ و 79٪ على التوالي (الشكل 5E-F). فيما يتعلق بمعدل الإفراز ، لوحظت استجابة ثنائية القطب مع 55٪ من الخلايا المفرزة IL-6 هي إفرازات بطيئة و 39٪ كمفرزات سريعة (الشكل 5G).
لمزيد من توصيف سلوك الإفراز ، تم رسم واصفات المنحنى لكل خلية مقابل بعضها البعض وتم استخراج مجموعات مختلفة (الشكل 5H-J). لم يتم إعطاء ارتباط واضح بين tstart و Cmax (الشكل 5H): كان أكبر مجموعتين من الإفرازات المنخفضة المبكرة والإفرازات العالية مستقلة عن بداية الإفراز. بالنظر إلى العلاقة بين tstart و SRlin (الشكل 5I) ، كانت معظم الخلايا عبارة عن إفرازات بطيئة مبكرة مع مجموعة واضحة من الإفرازات العالية المبكرة وعدد قليل من الإفرازات البطيئة / المتوسطة إلى المتأخرة. فيما يتعلق بارتباطات SRlin و Cmax (الشكل 5J) ، لم تكن هناك إفرازات سريعة منخفضة إلى متوسطة تقريبا ، مع وجود عدد أكبر فقط من الإفرازات المنخفضة السريعة. علاوة على ذلك ، كان هناك عدد كبير من الإفرازات السريعة التي لا تعتمد على الحد الأقصى للتركيز المقاس ، ومجموعتان من الإفرازات العالية تفرز إما بطيئة أو سريعة. باختصار ، يمكن الاستنتاج أن التحقيق في العلاقة بين واصفات المنحنى للخلايا الفردية ينتج عنه تحليل أكثر تفصيلا ويمكن أن يستخرج نتائج بيولوجية جديدة من قياسات إفراز الخلية الواحدة.
من خلال التحليل المقدم أعلاه ، استخلصنا ديناميكيات إفراز خلايا الإفراز المشترك (الشكل 6). يظهر مثالان منحنيان ديناميكيات مختلفة للإفراز المشترك ل IL-6 و TNFα من خليتين مفردتين مع بداية متزامنة لكلا السيتوكينات (الشكل 6A) ، أو بداية إفراز متسلسلة ، مع إفراز IL-6 أولا (الشكل 6B). لتصنيف جميع خلايا الإفراز المشترك ، تم تحديد تأخير إفراز مدته 60 دقيقة ، حيث تعتبر جميع الخلايا التي تبدأ الإفراز ضمن هذا النطاق إفرازات متزامنة وجميع الخلايا ذات التأخيرات الأطول تعتبر إفرازات متسلسلة. سمح هذا التحليل أيضا بإمكانية ملاحظة السيتوكين الذي تم إفرازه أولا. بالنسبة ل IL-6 و TNFα ، لوحظ إفراز مشترك متزامن بشكل أساسي في 76٪ من الخلايا (الشكل 6C) ، بينما بالنسبة ل IL-6 و IL-1β ، لوحظ إفراز مشترك متسلسل في 86٪ من الخلايا مع كون IL-6 أول سيتوكين يتم إفرازه في معظم الحالات (الشكل 6D).
بالنظر إلى وقت بدء إفراز السيتوكينات المختلفة لجميع الخلايا الفردية التي تفرز بشكل مشترك، لم يلاحظ وجود ارتباط واضح بين أوقات بدء الإفراز في التجارب التي أجريت. بالنسبة للإفراز المشترك IL-6 و TNFα (الشكل 6E) ، كانت هناك مجموعة رأسية أكبر حوالي 0 دقيقة ، تتوافق مع خلايا الإفراز المشترك بشكل أكثر انتشارا بدءا من IL-6. بالنسبة للإفراز المشترك IL-6 و IL-1β (الشكل 6F) ، بدأت معظم الخلايا في إفراز IL-6 في بداية القياس ، بينما تم إفراز IL-1β بشكل أساسي لاحقا. باختصار ، مكن التحليل المقدم هنا من تحديد مجموعات فرعية مختلفة من الإفرازات وديناميكيات إفراز السيتوكين المشترك المعقدة.
الشكل 5: تحليل مفصل لأنماط ديناميكية إفراز مختلفة لمنحنيات الخلايا المفرزة أحادية IL-6. (أ) بيانات تركيز السيتوكين أحادية الخلية التمثيلية خلال وقت القياس مع منحنى السيني المجهز والمعلمات المستخرجة. (ب-د) ثلاثة منحنيات نموذجية لتركيز السيتوكين أحادي الخلية لأنواع إفراز السيتوكين المختلفة الموجودة لإفراز IL-6 بعد تحفيز LPS. (E-G) النسب المئوية لخلايا إفراز IL-6 المصنفة إلى أنواع إفراز مختلفة بالمعايير التالية (ن = 633):الحد الأقصى ل EC: منخفض <5 نانومتر ، مرتفع > 19.5 نانومتر ، F. tالبداية: في وقت مبكر <30 دقيقة ، أواخر > 120 دقيقة ، G.SR lin: بطيء <250 جزيء / ثانية ، سريع >750 جزيء / ثانية. (H-J) العلاقة بين واصفات منحنى الإفراز الثلاثة Cكحد أقصى ، tstart و SRlin لكل خلية فردية (n = 633). ينتج عدد السكان الكبير عند Cmax = 20nM عن الوصول إلى الحد الأعلى للكشف عن الفحص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: استخلاص أنماط الإفراز المشترك من منحنيات تركيز الخلية الواحدة. (A-B) منحنيات التركيز التمثيلية للخلايا المفردة التي تفرز IL-6 و TNFα (A) في وقت واحد و (B) بالتتابع ، على التوالي. (ج-د) النسبة المئوية للخلايا التي تظهر إفرازا متزامنا ومتسلسلا ل IL-6 و TNFα (n = 249) ، أو IL-6 و IL-1β (n = 72) ، على التوالي. يتم تعريف الإفراز المتسلسل من خلال التأخير بين بدء إفراز السيتوكين لأكثر من 60 دقيقة. تشير الألوان إلى أي من السيتوكينات بدأ الإفراز أولا. (إ-و) العلاقة بين أوقات بدء الإفراز للسيتوكينات المختلفة لكل خلية إفرازية (nIL6-TNFα = 249 ، nIL6-IL1β = 72). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كثيرا ما يتم التحقيق في إطلاق السيتوكين وإفرازه في علم المناعة والطب السريري3. يمكن أن يؤدي إفراز السيتوكين غير المتوازن إلى آثار ضارة للمرضى الذين يعانون من الالتهابات ولكن أيضا في الأمراض العصبية أو الالتهاب أو السرطان26،27،28. على الرغم من أن أهميتها في الصحة والمرض راسخة ، إلا أن دراسة السيتوكينات وخلاياها المفرزة لا تزال صعبة لأن المنهجيات الحالية غير قادرة على الكشف بدقة عن السيتوكينات الناشئة من خلية واحدة وقياسها بطريقة تم حلها بمرور الوقت. بالنسبة لسير العمل المقدم هنا ، تم استخدام بروتوكول تحفيز ثابت مع PBMC وتم قياس إفرازها من IL-6 و TNF-α و IL-1β. نشأ اختيار استخدام PBMCs بدلا من المجموعات السكانية الفرعية الفردية المنقاة من التطبيق السابق للتحقيق في متلازمات إطلاق السيتوكين (CRS)23 ، وهي حالة تتميز بتركيزات بلازمية مرتفعة للغاية من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك IL-6 و TNF-α و IL-1β29. نظرا لأن CRS لا يرتبط عادة بمجموعة سكانية واحدة فقط ، فقد استخدمنا PBMCs لأنها ستكون موجودة في الجسم الحي. ومع ذلك ، يمكن تنقية المجموعات الفرعية الخلوية وتقييمها بشكل فردي ، إذا كان السؤال العلمي يتطلب هذه الخطوة. تم تحسين وقت الحضانة وظروف التحفيز ونطاقات الفحص الديناميكي لقياس إفراز السيتوكينات الثلاثة ذات الأهمية. يوضح سير العمل والبيانات المعروضة هنا كيفية إعداد ومعايرة وقياس وقياس وتحليل إفراز الخلية الواحدة الذي تم حله بمرور الوقت لسيتوكينات متعددة. يوفر هذا البروتوكول مخططا حول كيف يمكن للتحليل متعدد الوظائف لإفراز السيتوكين أن يتيح التنوع الوظيفي والديناميكي الكبير للسيتوكين الذي يفرز في المرضى.
تتيح العديد من الجوانب الحاسمة لبروتوكول الفحص الموصوف قراءات بيولوجية فريدة. أولا ، سمح تغليف الخلية الواحدة في قطرات الموائع الدقيقة باستخراج البيانات لكل خلية على حدة. يمكن الكشف عن أحداث تغليف الخلايا المتعددة وفرزها داخل أو خارج عن طريق تحليل الصور ، اعتمادا على سؤال البحث. ثانيا ، سمح إدراج العديد من المقايسات المناعية الفلورية المستقلة في القطيرات ومحاذاة الجسيمات النانوية الوظيفية بالقياس الكمي لما يصل إلى ثلاثة تركيزات من السيتوكين بالتوازي. مكن هذا الإرسال المتعدد من تحليل أنماط إفراز السيتوكين المشترك على مستوى خلية واحدة. ثالثا ، سمح تجميد القطرات بالقياس الزمني وارتباط إفراز السيتوكين لكل خلية إفرازية وسمح بالتمييز بين الإفراز المشترك والإفراز المتسلسل. قدمت دقة الوقت بشكل فريد بيانات عن أنماط الإفراز والمجموعات السكانية الفرعية لأنواع الإفرازات المختلفة. وأخيرا، مكن تحليل الصور المتوازي من استخراج وتتبع كميات كبيرة من البيانات بكفاءة من القياسات مع أكثر من 20000 خلية فردية. سمح الاستخراج من منحنيات الإفراز الفردي باكتشاف مجموعات فرعية من النمط الظاهري ووظائفه.
بجانب قراءته الفريدة ، يتمتع الفحص أيضا بمزايا تقنية مقارنة بتحليل السيتوكين القياسي. بفضل الحجم الصغير لحجرات التغليف التي تبلغ حوالي 60 مل ، يمكن اكتشاف كميات مطلقة من السيتوكينات المفرزة مباشرة من المصدر البيولوجي مع حدود الكشف التي تناسب إفراز الخلية. يستخدم تصغير الفحص أيضا كميات أقل من الكواشف الحيوية باهظة الثمن. علاوة على ذلك ، يتطلب الإعداد القليل جدا من المعدات المتخصصة ، والتي غالبا ما تكون متاحة بالفعل في مختبرات البيولوجيا والهندسة الحيوية. تتوفر المجاهر الفلورية على نطاق واسع ، وكثيرا ما تستخدم مضخات الحقن في مختبرات الهندسة الحيوية أو يمكن شراؤها بتكلفة منخفضة نسبيا. في حالة وجود مزرعة خلوية ، تبلغ تكلفة المعدات الكاملة اللازمة لإجراء التجارب حوالي 148000 يورو ، مع مساهمة الغالبية بواسطة المجهر الفلوري الآلي (130000 يورو). ومع ذلك ، يمكن العثور على مثل هذه الأداة في كثير من الأحيان في المختبرات البيولوجية ، ويتم توزيع بقية التكلفة على مضخة الحقنة (13000 يورو ، ولكن تتوفر بدائل أرخص) ومعدات أصغر. تم وصف تصنيع رقاقة القطيرات وغرفة المراقبة بشكل جيد للغاية17 ويمكن إجراؤها خارج بيئة غرف الأبحاث مع البنية التحتية اللازمة ، مثل الأفران ومنظفات البلازما الموجودة في معظم مختبرات الهندسة الحيوية. بدلا من ذلك ، يتوفر موردون مختلفون لتزويد المختبرات المهتمة برقائق مولد القطيرات. نظرا للأحجام الصغيرة المطلوبة ، فإن الفحص فعال من حيث التكلفة وسهل الإعداد.
لضمان أعلى درجة من التكرار ، حددنا بعض الخطوات الحاسمة لنجاح البروتوكول. مشكلة شائعة للمستخدمين لأول مرة هي حركة القطيرات أثناء القياس. في حين أن برنامج التحليل يمكنه تتبع القطرات الفردية إلى حد ما ، فإن الحركة المفرطة تؤدي إلى فقدان دقة الخلية الواحدة والنتائج غير الدقيقة. يمكن تجنب الحركة باستخدام غرف قياس محكمة الإغلاق بشكل صحيح ، وحجم القطرات الصحيح وأحجام الغرف ، وفترة توازن قصيرة قبل بدء القياس ، وتركيز الفاعل بالسطح المناسب. خطوة أخرى حاسمة هي التركيز الدقيق قبل بدء القياس. يؤدي التركيز غير السليم إلى انخفاض كبير في قيم نقل التألق والتقليل من كمية السيتوكين المفرز. أخيرا ، اعتمادا على السؤال والبروتوكول المطروح ، يعد التوقيت الصحيح بين الخطوات المختلفة ذا أهمية قصوى لقابلية التكاثر. يجب أن يكون وقت الانتظار بين ملء الغرفة وبدء القياس متسقا ، وإلا فقد يتم تفويت نافذة قياس السيتوكينات المفرزة.
تشمل قيود التكنولوجيا المقدمة القدرة المحدودة على زيادة التلاعب بالخلايا بعد التغليف. لذلك لا يمكن حاليا إضافة أو إزالة المنشطات أو الأجسام المضادة أو الكواشف الإضافية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن الخلايا مغلفة في مفاعلها الحيوي المعزول ، فلا يمكن إجراء تفاعلات بين الخلايا (الإشارات القائمة على الاتصال أو paracrine) أثناء القياس. يمكن التغلب على هذا القيد جزئيا من خلال الحضانة السائبة مسبقا. إلى جانب ذلك ، من الممكن أيضا تعزيز تأثيرات autocrine من السيتوكينات المفرزة ولا يمكن تحديد هذه التأثيرات أو استبعادها على وجه اليقين ، حيث يتم قياس السيتوكينات المفرزة المكتشفة بالأجسام المضادة فقط. لذلك ، يجب دائما وصف وجهة النظر المعزولة حول إفراز السيتوكين في سياق السؤال والتطبيق المقابلين. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذا القيد للدراسة التفصيلية للمضاعفات المغلفة والمزدوجة والثلاثية إذا كانت ذات أهمية. سيوفر هذا إعدادا مثيرا للاهتمام مفيدا للتحقيق في الاتصال بالخلية أو الأسئلة القائمة على paracrine. أخيرا ، النطاق الديناميكي للفحص محدود ويحتاج إلى التكيف مع التطبيق المحدد. هنا ، قمنا بتكييف النطاق الديناميكي للفحص مع الكمية المفرزة المتوقعة من السيتوكينات المقاسة.
ولزيادة تعزيز قدرات الفحص وإمكانية تطبيقه، يمكن معالجة العديد من التطورات في المستقبل، في الجوانب البيولوجية والتقنية وتحليل البيانات. على الجانب البيولوجي ، يمكن دمج قياس السيتوكينات الإضافية أو البروتينات المفرزة الأخرى أو علامات التمثيل الغذائي أو سطح الخلية عن طريق تكييف الفحص. علاوة على ذلك ، يمكن دمج هذا الفحص في سير العمل جنبا إلى جنب مع المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا لتوسيع القراءات (على سبيل المثال ، تلطيخ التدفق الخلوي أو التسلسل). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تبسيط قابلية استخدام الفحص ، على سبيل المثال ، عن طريق إنشاء شريحة موائع دقيقة متكاملة لإنشاء القطيرات ومراقبتها ، مما قد يتيح تطبيقا أوسع خارج مختبرات الهندسة الحيوية في بيئة سريرية. فيما يتعلق بتحليل البيانات ، يمكن توسيع استخراج وتتبع المعلومات من الصور من خلال تعزيز الأتمتة واستخدام نهج التعلم الآلي ، على سبيل المثال ، للكشف عن وجود وموضع الخلية (الخلايا) وخط الخرز في كل قطرة دون وضع علامات على الفلورسنت. سيؤدي القيام بذلك إلى فتح قنوات فلورية إضافية يمكن استخدامها للمقايسات المناعية ، مما يؤدي إلى قياس المزيد من السيتوكينات بالتوازي.
يمكن تطبيق الفحص المقدم والبروتوكولات والتحليلات المرتبطة به على حالات الاستخدام المحتملة المتنوعة المتعلقة بديناميكيات إفراز السيتوكينات. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن أن يعالج الفحص الأسئلة المناعية الأساسية مثل تحديد نوع الخلية وملفات إفراز السيتوكين الخاصة بالتنشيط ، أو تعدد وظائف الخلايا المفرزة للسيتوكين ، أو الآليات الزمنية والصيانة لأرصدة السيتوكينات. علاوة على ذلك ، في التطبيقات السريرية ، قد تمكن المنصة من كشف دور السيتوكينات أثناء الاستجابات الالتهابية النشطة أو المزمنة ، كما لوحظ في COVID-1930 ، أو توفر أداة لتقسيم المرضى إلى طبقات وتخصيص العلاجات بناء على توقيعات فريدة كما هو الحال في الالتهاب الذاتي31. في الختام ، يعد التقييم الكمي الذي تم حله زمنيا لإفراز السيتوكين من الخلايا المفردة طريقة مطلوبة بشدة لأنه يوضح كيف يؤدي دواء معين أو عدوى أو تغيير جيني أو تحفيز خارج الجسم الحي إلى استجابة معينة.
تم تسجيل براءة اختراع جوانب محددة مثل قياسات خط الخرز للخلايا.
تم دعم هذا المشروع من خلال المنحة # 2021-349 من مجال التركيز الاستراتيجي للصحة الشخصية والتقنيات ذات الصلة (PHRT) لمجال ETH (المعاهد الفيدرالية السويسرية للتكنولوجيا) ، ومنحة بدء مجلس البحوث الأوروبي (منحة # 803,336) ، والمؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (منحة #310030_197619). بالإضافة إلى ذلك ، نشكر Guilhem Chenon و Jean Baudry على عملهما وتطوير محلل DropMap الأولي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
008-FluoroSurfactant | RAN Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-10G | |
2-Stream flow-focusing droplet maker, 30 µm nozzle, PFOS hydrophobic surface treatment | Wunderli chips | ||
Alexa Fluor 647 NHS Ester | ThermoFisher | A20006 | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/fluorescent-amine-reactive-alexa-fluor-dye-labeling-of-igm-antibodies.html |
Anti-Human IL-1β (Monoclonal Mouse), AF647 labelled in-house | PeproTech | 500-M01B | |
ARcare92524 double-sided adhesive tape | Adhesvies Reasearch | ARcare92524 | |
Bio-Adembeads Streptavidin plus 300nm | Ademtech | Cat#03233 | |
Biotinylated Goat Anti-Human IL-1β | PeproTech | 500-P21BGBT | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
Cell Scraper | TPP | 99002 | |
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34557 | Cell staining solution |
Chromafil Xtra PTFE-45/25 syringe filters | Macherey-Nagel | 729205 | |
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment | Corning | 3471 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
D-Biotin | Fluorochem | M02926 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14196-094 | |
epT.I.P.S. Standard 2-200 µl | Eppendorf | 30000889 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution | Sigma-Aldrich | 3690 | |
EZ-LINK-NHS-PEG4-Biotin | ThermoFisher | A39259 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20217 |
FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
Handy dish soap | Migros | 5.01002E+11 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
HFE-7500 Oil 3M TM Novec | Fluorochem | B40045191 | |
Idex F-120 Fingertight One-Piece Fitting, Standard Knurl, Natural PEEK, 1/16" OD Tubing, 10-32 Coned | Cole-Parmer | GZ-02014-15 | |
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-13A5 - Rat), FITC | ThermoFisher | 11-7069-81 | |
IL-6 Monoclonal Antibody (MQ2-39C3), Biotin | ThermoFisher | 13-7068-85 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | 10828-010 | |
Loctite AA 3491 curable UV glue | Henkel AG & Co | 3491 | |
Microscope slides (76x26x1mm, clear white) | Menzel Gläser | ||
Mineral oil light | Sigma-Aldrich | 330779 | |
NanoPort Assembly Headless, 10-32 Coned, for 1/16" OD | Idex | N-333 | |
Neodymium block magnet | K&J Magnetics | BZX082 | |
Omnifix-F Spritze, 1 ml, LS | Braun | 9161406V | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | ThermoFisher | P6866 | |
Precision wipes | Kimtech Science | 5511 | |
PTFE microtubing 0.30 × 0.76 mm | FisherScientific | 1191-9445 | |
PTFE microtubing 0.56 × 1.07 mm | FisherScientific | 1192-9445 | |
Recombinant Human IL-1β | Peprotech | Cat#200-01B | |
Recombinant Human IL-6 | Peprotech | Cat#200-06 | |
Recombinant human serum albumine (HSA) | Sigma-Aldrich | A9731 | |
Recombinant Human TNF-α | Peprotech | Cat#300-01A | |
Reusable biopsy punch diameter 0.75 mm and 6 mm | Stiefel | 504529 and 504532 | |
RPMI 1640 Medium, no phenol red | Gibco | 11835-030 | |
Standard LPS, E. coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Sterican needles 23 G for 0.56 mm diameter microtubing | FisherScientific | 15351547 | |
Sterican needles 27 G for 0.30mm diameter microtubing | FisherScientific | 15341557 | |
TNF alpha Monoclonal Antibody (MAb11), PE | ThermoFisher | 12-7349-81 | |
TNF-alpha Monoclonal Antibody (MAb1), biotinylated in-house | ThermoFisher | 14-7348-85 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99500 | |
Devices | |||
Cameo 4 automatic cutting machine | Silhouette | ||
Cetoni Base 120 + 3x NEMESYS Low Pressure Syringe Pumps | Cetoni | NEM-B101-03 A | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher | ||
Inverted Epi-fluorescence microscope Ti2 | Nikon | ECLIPSE Ti2-E, Ti2-E/B*1 | |
OKO Lab Cage Incubator, dark panels | OKO Lab | ||
ORCA-Fusion Digital CMOS camera | Hammatsu | C14440 | |
SOLA Light Engine | Lumencor | sola 80-10247 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved