13C6-وسم الجلوكوز المرتبط ب LC-MS: تحديد الأعضاء الأولية للنبات في تخليق الأيض الثانوي

Summary

الطريقة المطورة لوضع العلامات ^{على الجلوكوز 13}C_6-جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي عالي الدقة للكروماتوغرافيا السائلة متعددة الاستخدامات وتضع الأساس للدراسات المستقبلية حول الأعضاء والمسارات الأولية المشاركة في تخليق المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية ، وكذلك الاستخدام الشامل لهذه المستقلبات الثانوية.

Abstract

تقدم هذه الورقة طريقة جديدة وفعالة لاعتماد الأعضاء الأولية المشاركة في تخليق الأيض الثانوي. كأهم مستقلب ثانوي في باريسبوليفيلا فار يونانينسيس (فرانش.) يد. -Mzt. (PPY) ، باريس سابونين (PS) لديها مجموعة متنوعة من الأنشطة الدوائية و PPY في زيادة الطلب. أنشأت هذه الدراسة حزمة الأوراق والجذور والأوعية الدموية ^{الجذعية 13}C_6-تغذية الجلوكوز وعدم التغذية بأربعة علاجات للتصديق بدقة على الأعضاء الأولية المشاركة في تخليق باريس سابونين السابع (PS VII). من خلال الجمع بين قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) ، تم حساب نسب ¹³C / ¹²C للأوراق والجذور والساق والجذر في معالجات مختلفة بسرعة وبدقة ، وتم العثور على أربعة أنواع من نسب ذروة الأيونات النظيرية PS (M⁻): (M + 1) ^- / M ⁻ ، (M + 2) ^- / M ⁻ ، (M + 3) ^- / M ⁻ و (M + 4) ^- / M⁻. أظهرت النتائج أن نسبة ¹³درجة مئوية / ¹²درجة مئوية في جذور حزمة الساق والأوعية الدموية وعلاجات تغذية الجذور كانت أعلى بكثير من تلك الموجودة في العلاج غير التغذوي. بالمقارنة مع المعالجة غير التغذوية ، زادت نسبة جزيئات PS VII (M + 2) ^- / M ⁻ في الأوراق بشكل ملحوظ تحت معالجات تغذية الأوراق والأوعية الدموية الجذعية. في الوقت نفسه ، مقارنة بالمعالجة غير المغذية ، لم تظهر نسبة جزيئات PS VII (M + 2) ^- / M ⁻ في الأوراق تحت معالجة جذمور أي فرق كبير. علاوة على ذلك ، لم تظهر نسبة جزيئات PS VII (M + 2) ^- / M ⁻ في الساق والجذر والجذمور أي اختلافات بين العلاجات الأربعة. بالمقارنة مع المعالجة غير المغذية ، لم تظهر نسبة جزيء باريس سابونين II (PS II) (M + 2) ^- / M ⁻ في الأوراق تحت معالجة تغذية الأوراق أي فرق كبير ، وكانت نسبة (M + 3) ^- / M ⁻ لجزيئات PS II في الأوراق تحت معالجة تغذية الأوراق أقل. أكدت البيانات أن العضو الأساسي لتوليف PS VII هو الأوراق. إنه يضع الأساس لتحديد الأعضاء والمسارات الأولية المشاركة في تخليق المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية في المستقبل.

Introduction

مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية في النباتات معقدة ومتنوعة ، وتشمل أعضاء تراكم محددة ومتنوعة للغاية¹. في الوقت الحاضر ، لم يتم تحديد مواقع التوليف المحددة والأجهزة المسؤولة عن المستقلبات الثانوية في العديد من النباتات الطبية بشكل جيد. يشكل هذا الغموض عقبة كبيرة أمام التقدم الاستراتيجي وتنفيذ طرق الزراعة المصممة لتحسين كل من إنتاجية وجودة المواد الطبية.

يتم استخدام البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية وتقنيات وضع العلامات على النظائر على نطاق واسع لكشف مسارات التوليف ومواقع المستقلبات الثانوية في النباتات الطبية^2،3،4

Protocol

1. التحضير التجريبي

1. تأكد من أنه أثناء نمو النبات ، تكون الرطوبة النسبية للاحتباس الحراري 75٪ ، ودرجات الحرارة ليلا ونهارا 20 درجة مئوية / 10 درجة مئوية ، وتتكون الفترة الضوئية من 12 ساعة نهارا و 12 ساعة ليلا ، وشدة الضوء 100 ميكرومول · م ^-2 · ث ^-1. توفير الإشعاع عبر مصابيح الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) ، مع الحفاظ على مسافة 30 سم بين مصباح LED ومظلة المصنع.
   ملاحظة: الفترة الضوئية وشدة الضوء وفقا لعدد ساعات سطوع الشمس خلال فترة النمو في يونان. يتم قياس الإشعاع بشكل روتيني بواسطة مستشعر كمي (انظر جدول المواد). قم بإجراء التغييرات اللازمة في المعلمات البيئية وفقا لخصائص النبات الطبي. بمجرد معايرة هذ....

النتائج

للتأكد من أن إمداد ¹³C_6-Glucose في الجذور كان ناجحا ، قمنا بتحليل نسب نظائر ¹³C / ¹²C في الجذور. كانت نسب النظائر ¹³C / ¹²C للمعالجات 3 و 4 أعلى بكثير من تلك الخاصة بالعلاج 2 (الشكل 1 أ). أشارت النتائج إلى أن ¹³C_6-Glucose من العلاج 3 و 4 دخلت الجذور من خ.......

Discussion

يتوقف التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول على البحث الشامل في الخصائص الفسيولوجية للنبات والأنسجة والأعضاء والمستقلبات الثانوية. يضع نهج التصميم التجريبي المبين في البروتوكول أساسا قويا للتحقيق في مسارات التخليق الحيوي للمستقلبات الثانوية النباتية. العوامل الحاسمة في هذه التجربة هي (1) تحد?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2