مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا التائية الأولية للفأر والفحص المجهري بفاصل زمني لهجرة الخلايا التائية في ظل ظروف بيئية محددة مع التحليل الكمي.

Abstract

تعتمد الاستجابة المناعية التكيفية على قدرة الخلية التائية على الانتقال عبر الدم والليمفاوية والأنسجة استجابة لمسببات الأمراض والأجسام الغريبة. هجرة الخلايا التائية هي عملية معقدة تتطلب تنسيق العديد من مدخلات الإشارة من البيئة والخلايا المناعية المحلية ، بما في ذلك الكيموكينات ومستقبلات الكيموكين وجزيئات الالتصاق. علاوة على ذلك ، تتأثر حركة الخلايا التائية بالإشارات البيئية المحيطة الديناميكية ، والتي يمكن أن تغير حالة التنشيط ، والمناظر الطبيعية للنسخ ، وتعبير جزيء الالتصاق ، والمزيد. في الجسم الحي ، يجعل تعقيد هذه العوامل المتشابكة على ما يبدو من الصعب التمييز بين الإشارات الفردية التي تساهم في هجرة الخلايا التائية. يوفر هذا البروتوكول سلسلة من الطرق من عزل الخلايا التائية إلى التحليل بمساعدة الكمبيوتر لتقييم هجرة الخلايا التائية في الوقت الفعلي في ظل ظروف بيئية محددة للغاية. قد تساعد هذه الظروف في توضيح الآليات التي تنظم الهجرة ، وتحسين فهمنا لحركية الخلايا التائية وتوفير أدلة ميكانيكية قوية يصعب تحقيقها من خلال التجارب على. إن الفهم الأعمق للتفاعلات الجزيئية التي تؤثر على هجرة الخلايا أمر مهم لتطوير علاجات محسنة.

Introduction

الخلايا التائية هي المستجيبات الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية المتخصصة لمولد الضد. على مستوى المجتمع الإحصائي، الخلايا التائية غير متجانسة، وتتكون من مجموعات فرعية خلوية ذات وظائف متخصصة متميزة. الأهم من ذلك ، أن الخلايا التائية CD8 + هي المستجيبات الخلوية الرئيسية للجهاز المناعي ، والتي تقضي بشكل مباشر على الخلايا المصابة أو المختلة^{وظيفيا 1}.

تتواجد الخلايا التائية CD8+ الناضجة في الأنسجة وتنتشر عبر الدم والليمفاوية بحثا عن المستضدات. أثناء العدوى، تقدم الخلايا التائية مولدات ضد في الدم أو الأنسجة، وتصرف بسرعة إلى الطحال أو أقرب عقدة ليمفاوية مصاصة لبدء استجابة مناعية مثمرة. في كلتا الحالتين، تنشط الخلايا التائي....

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكولات من قبل لجنة الجامعة للموارد الحيوانية في جامعة روتشستر. تم الحفاظ على الفئران في هذه الدراسة في الفضاء الخالي من مسببات الأمراض في منشأة بجامعة روتشستر. تم استخدام ذكور / إناث الفئران C57BL / 6 ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-12 أسبوعا (15-30 جم) ، في هذه الدراسة. يمكن إجراء عزل أنسجة الفئران على سطح الطاولة مع قفازات لتغطية اليدين وقناع للوجه لتغطية الأنف والفم ، أو داخل خزانة السلامة البيولوجية. يجب إجراء جميع عمليات زراعة الخلايا وإعداد الألواح في خزانة السلامة البيولوجية. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تنقية الخلايا التائية CD8 ⁺ وتنشيطها

النتائج

يمكن تأكيد تنشيط الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي ، والبحث عن زيادة التعبير عن CD69 و CD44 ، وهما علامتان أساسيتان للتنشيط في الخلايا التائية^{الفئران 6}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد نقاء مجموعة الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي لخلايا CD3 ⁺ CD8 ⁺ T. تنتج ه.......

Discussion

إن فهم التأثير البيولوجي للإشارات المتقاربة في الجسم الحي أمر صعب وليس من السهل تفسيره. توفر البروتوكولات المقدمة هنا طريقة معقولة لفهم هجرة الخلايا التائية في ظروف محددة للغاية وذات صلة بيولوجية. يمكن تحديد هذه الشروط بناء على تقدير الباحث ، ويمكن تعديل البروتوكولات لتناسب احتياجا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm dish	Corning	353003	or equivalent
15 mL conical tube	ThermoFisher	339650	or equivalent
1x DPBS	Gibco	14190144	without calcium and without magnesium
6 well plate non-TC treated	Corning	3736	or equivalent
70 µm cell strainer	FisherScientific	352350	or equivalent
ACK lysing buffer	ThermoFisher	A1049201	or equivalent
Allegra 6KR centrifuge	ThermoScientific	sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket	or equivalent
Beta mercaptoethanol	Sigma	M3148	or equivalent
CellTrace Violet	ThermoFisher	C34571	Or equivalent
Centrifuge	ThermoScientific	Sorvall ST 16R	or equivalent
Collagen (IV)	Corning	354233	or equivalent
DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear	Bioptechs	04200417C
Dynabeads Sheep anti-Rat IgG	Invitrogen	11035
DynaMag 15 Magnet	ThermoFisher Scientific	12301D	or equivalent
Easy sep mouse T cell isolation kit	Stem Cell	19851
FBS	SigmaAldrich	F2442-500ML	or equivalent
Fibronectin	SigmaAldrich	10838039001	or equivalent
Fiji		http://fiji.sc/	weblink
Filter cubes	Nikon or Olympus
GK1.5	ATCC	TIB-207
HEPES	ThermoFisher	15630080	or equivalent
HQ CCD camera	CoolSNAP		or equivalent
ImageJ		http://imagej.nih.gov/ij/h	weblink
ImageJ automatic tracking plug in		http://imagej.net/TrackMate	weblink
ImageJ manual tracking plug in		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html	weblink
L-15	Various	See Materials	Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose
Liebovitz's L-15 medium, no phenol red	ThermoFisher	21083027
Luer Lok disposable syringe	Fisher Scientific	14-955-459	or equivalent
Lymphocyte separation medium	Corning	25-072-CI	or equivalent
M5/114	ATCC	TIB-120
MEM Non-Essential Amino Acids	ThermoFisher	11140050	or equivalent
Microscope heating system	Okolab	okolab.com	Custom designs available
Millicell EZ slide	Millipore	C86024
Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit	Biolegend	480043
Mouse E-cadherin	R&D systems	8875-EC-050	or equivalent
Mouse surgical dissection kit	Fisher Scientific	13-820-096	or equivalent
NIS elements	Nikon		Software
non-TC 24wp	Corning	353047	or equivalent
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	15140122	or equivalent
Protein A	ThermoFisher Scientific		or equivalent
R9	Various	See Materials	Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich)
Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera	R&D systems	796-IC-050	or equivalent
Recombinant Mouse IL2	Biolegend	575410	or equivalent
RPMI 1640x	ThermoFisher	11875093	or equivalent
T pins	Fisher Scientific	S99385	or equivalent
TE2000-U microscope	Nikon		or equivalent
Various recombinant mouse chemokine	R&D systems		or equivalent
VCAM-1 Fc chimera	R&D systems	643-VM-050	or equivalent
Volocity	PerkinElmer		Software