عزل نخاع عظم الفأر الوليدي وإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة غير إنزيمية ومباشرة لعزل خلايا نخاع عظم الفأر الوليدي البالغة من العمر 7-9 أيام وتوليد بلاعم متباينة باستخدام طاف من خلايا L929 كمصدر لعامل تحفيز مستعمرة المحببات (M-CSF). تم تحليل الضامة المشتقة من نخاع العظم بشكل أكبر للمستضدات السطحية F4 / 80 و CD206 و CD11b والكفاءة الوظيفية.

Abstract

تم تأسيس تقنيات مختلفة لعزل نخاع العظم عن الفئران البالغة. ومع ذلك ، فإن عزل نخاع العظم عن الفئران الوليدية يمثل تحديا ويستغرق وقتا طويلا ، ولكن بالنسبة لبعض النماذج ، فهو مناسب وضروري من الناحية الانتقالية. يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة ومباشرة لإعداد خلايا نخاع العظم من الجراء البالغة من العمر 7-9 أيام. يمكن بعد ذلك عزل هذه الخلايا أو تمايزها إلى أنواع معينة من الخلايا ذات الأهمية. البلاعم هي خلايا مناعية حاسمة تلعب دورا رئيسيا في الالتهاب والعدوى. أثناء التطور ، تساهم البلاعم الوليدية بشكل كبير في إعادة تشكيل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يختلف النمط الظاهري ووظائف الضامة الوليدية عن نظيراتها البالغة. يحدد هذا البروتوكول أيضا تمايز البلاعم الوليدية عن خلايا نخاع العظم المعزولة في وجود وسط مكيف L929. تم تقييم الواسمات السطحية للبلاعم الوليدية المتمايزة باستخدام تحليل التدفق الخلوي. لإثبات الوظيفة ، تم اختبار كفاءة البلعمة أيضا باستخدام الإشريكية القولونية المقترنة الحساسة للصبغة ذات الأس الهيدروجيني.

Introduction

يحيط نخاع العظم بمجموعات الخلايا الجذعية المكونة للدم واللحمة المتوسطة التي تكون ذاتية التجدد ويمكن تمييزها إلى سلالات خلايا مختلفة. تؤدي الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظم إلى ظهور سلالات نخاعية ولمفاوية¹. تنتج الخلايا الجذعية الوسيطة بانيات العظم (العظام) أو الخلايا الشحمية (الدهون) أو الخلايا الغضروفية (الغضروف⁾². هذه الخلايا لها تطبيقات متعددة في مجال بيولوجيا الخلية وهندسة الأنسجة ، بما في ذلك العلاج الجيني ^3,4. تتمايز الخلايا السلفية الموجودة في نخاع العظم إلى أنواع معينة من الخلايا في وجود عوامل نمو خاصة بالنسب. يعزز الإريثروب....

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجان رعاية واستخدام المؤسسية في ولاية فرجينيا الغربية وتم تنفيذها وفقا لتوصيات دليل رعاية واستخدام المختبر من قبل المجلس الوطني للبحوث. تم استخدام الماوس C57BL / 6J لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد وسائل الإعلام

1. تحضير 3 مل من وسائط زراعة MEM مكملة ب 10٪ FBS ، 2 mM الجلوتامين ، 25 mM HEPES ، والبنسلين (100 U / mL) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) في أنبوب طرد مركزي 5 مل ، والاحتفاظ بها على الجليد.
2. إذا لزم الأمر لتخزين أسلاف نخاع العظم في النيتروجين السائل ، قم بإعداد وسائط تجميد تحتوي على 10٪ ....

النتائج

باستخدام الطريقة الموضحة في هذه الدراسة ، يمكن عزل 25 إلى 37 مليون خلية نخاع عظمي بنجاح من حجم فضلات خمسة جرو فأر C57BL / 6. تم التحقق من صحة هذه الطريقة بأحجام قمامة تتراوح من 5 إلى 7 جراء. كان الحد الأدنى لسن العزلة في تجاربنا هو 7 أيام. اعتمادا على حجم القمامة وعدد الخلايا المطلوبة للتجربة أقل من ?.......

Discussion

يمكن أن تمثل الأبحاث التي تتضمن نماذج الفئران الوليدية عددا من التحديات. يتمتع حديثو الولادة بجهاز مناعي متطور فريد من نوعه مقارنة بالبالغين⁸. على هذا النحو ، لا ينبغي افتراض أن البيانات الناتجة عن نماذج البالغة تنطبق على الأطفال حديثي الولادة ، وقد أوضحت العديد من الأعمال ال.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal