زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في هيدروجيل مع زيادة التعديل الحيوي الضوئي

Summary

نقدم هنا بروتوكولا يوضح استخدام الهيدروجيل كإطار زراعة خلايا ثلاثية الأبعاد (3D) لثقافة الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSC) وإدخال التعديل الحيوي الضوئي (PBM) لتعزيز انتشار ADSCs في بيئة الثقافة ثلاثية الأبعاد.

Abstract

غالبا ما تستخدم الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) ، التي تمتلك خصائص اللحمة المتوسطة متعددة القدرات المشابهة للخلايا الجذعية ، في الطب التجديدي نظرا لقدرتها على مجموعة متنوعة من تمايز الخلايا وقدرتها على تعزيز الهجرة والانتشار وتخفيف الالتهاب. ومع ذلك، غالبا ما تواجه كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي تحديات في البقاء على قيد الحياة والنقش داخل الجروح، ويرجع ذلك أساسا إلى الظروف الالتهابية غير المواتية. ولمعالجة هذه المشكلة، تم تطوير الهلاميات المائية للحفاظ على صلاحية كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSC) في الجروح وتسريع عملية التئام الجروح. هنا، نهدف إلى تقييم التأثير التآزري للتعديل الحيوي الضوئي (PBM) على انتشار ADSC والسمية الخلوية ضمن إطار زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. تم زرع كاليستيدات المعالجة المعمقة في هلاميات مائية سعة 10 ميكرولتر بكثافة 2.5 × 10³ خلايا وتعرضت للإشعاع باستخدام ثنائيات 525 نانومتر و825 نانومتر عند طلاقة 5 جول / سم² و 10 جول / سم². تم تقييم التغيرات المورفولوجية والسمية الخلوية والانتشار في 24 ساعة و 10 أيام بعد التعرض ل PBM. أظهرت ADSCs مورفولوجيا مستديرة وتم توزيعها في جميع أنحاء الهلام كخلايا فردية أو مجاميع كروية. الأهم من ذلك ، أن كلا من إطار زراعة PBM و 3D لم يظهرا أي تأثيرات سامة للخلايا على الخلايا ، في حين أن PBM عزز بشكل كبير معدلات انتشار ADSCs. في الختام، توضح هذه الدراسة استخدام الهيدروجيل كبيئة ثلاثية الأبعاد مناسبة لثقافة كؤوس التفاضل التفاضلي (ADSC) وتقدم PBM كاستراتيجية تعزيز مهمة، لا سيما معالجة معدلات الانتشار البطيئة المرتبطة بزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد.

Introduction

ADSCs هي خلايا سلفية متعددة القدرات وسيطة لها القدرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى عدة سلالات خلوية. يمكن حصاد هذه الخلايا من الجزء الوعائي اللحمي (SVF) للأنسجة الدهنية أثناء إجراء شفط الدهون¹. برزت كالتي تفاضل التفاضل التفاضلي (ADSCs) كنوع مثالي من الخلايا الجذعية لاستخدامها في الطب التجديدي لأن هذه الخلايا وفيرة، وطفيفة التوغل للحصاد، ويمكن الوصول إليها بسهولة، وتتميز بشكل جيد². يوفر العلاج بالخلايا الجذعية وسيلة ممكنة لالتئام الجروح عن طريق تحفيز هجرة الخلايا وتكاثرها والأوعية الدموية الجديدة وتقليل الالتهاب داخل الجروح ^3,4. ويعزى ما يقرب من 80٪ من القدرة ال....

Protocol

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول. تم تلخيص البروتوكول بيانيا في الشكل 1.

1. ثنائي الأبعاد (2D) ثقافة الخلية

ملاحظة: يتم تخزين كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (1 × 10⁶ خلايا) عند -195.8 درجة مئوية في النيتروجين السائل في قنينة حفظ بالتبريد تحتوي على 1 مل من وسائط تجميد الخلايا.

1. تحضير وسيط استعادة الخلايا 2D وقارورة الثقافة ثنائية الأبعاد
   1. نقل 39 مل من الوسط القاعدي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل
   2. إثراء الوسط القاعدي بمصل بقري جنيني بنسبة....

النتائج

لتقييم التشكل وفحص كثافة الخلايا للهلاميات المائية بصريا ، تم استخدام الفحص المجهري العكسي (الشكل 2). احتفظت ADSCs بمورفولوجيا مستديرة بعد 24 ساعة من البذر والتعرض ل PBM. كانت الخلايا منتشرة في جميع أنحاء الجل كخلايا مفردة أو في مجموعات تشبه العنب. لم يتغير التشكل بعد 10 أيام في ث?.......

Discussion

تعد كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) نوعا مثاليا من الخلايا لاستخدامها في الطب التجديدي لأنها تحفز العمليات المختلفة للمساعدة في التئام الجروح ^3,4. ومع ذلك ، هناك العديد من التحديات التي يجب التحايل عليها ، على سبيل المثال ، معدلات البقاء على قيد الحياة .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
525 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	EN 60825-1:2007
825 nm diode laser	National Laser Centre of South Africa	SN 101080908ADR-1800
96 Well Strip Plates	Sigma-Aldrich	BR782301
Amphotericin B	Sigma-Aldrich	A2942	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681	ATP reagent, Proliferation assay Kit
Corning 2 mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial	Corning	430659	cryovial
CryoSOfree	Sigma-Aldrich	C9249	Cell freezing media
CytoTox96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780	Cytotoxicity reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Media	Sigma-Aldrich	D5796	Basal medium (39 mL/44 mL)
FieldMate Laser Power Meter	Coherent	1098297
Flat-bottomed Corning 96 well clear polystyrene plate	Sigma-Aldrich	CLS3370
Foetal bovine serum	Biochrom	S0615	Culture medium enrichment (5 mL; 10% / 10 mL; 20%)
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma-Aldrich	H9394	Rinse solution
Heracell 150i CO2 incubator	Thermo Scientific	51026280
Heraeus Labofuge 400	Thermo Scientific	75008371	Plate spinner for 96 well plates
Heraeus Megafuge 16R centrifuge	ThermoFisher	75004270
Immortalized ADSCs	ATCC	ASC52Telo hTERT, ATCC SCRC-4000	Passage 37
Invitrogen Countess 3	Invitrogen	AMQAX2000	Automated cell counter for Trypan Blue
Julabo TW20 waterbath	Sigma-Aldrich	Z615501	Waterbath used to warm media to 37 °C
Olympus CellSens Entry	Olympus	Version 3.2 (23706)	Imaging software: digital image acquisition
Olympus CKX41	Olympus	SN9B02019	Inverted light microscope
Olympus SC30 camera	Olympus	SN57000530	Camera attached to inverted light microscope
Opaque-walled Corning 96 well solid polystyrene microplates	Sigma-Aldrich	CLS3912	Opaque well used for ATP luminescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Antibiotic (0.5%; 0.5 mL)
SigmaPlot 12.0	Systat Software Incorporated
TrueGel3D – True3	Sigma-Aldrich	TRUE3-1KT	10 µL
TrueGel3D Enzymatic Cell Recovery Solution	Sigma-Aldrich	TRUEENZ	01:20
Trypan Blue Stain	Thermo Fisher - Invitrogen	T10282	0.4% solution
TrypLE Select Enzyme (1x)	Gibco	12563029	Cell detachment solution
Victor Nivo Plate Reader	Perkin Elmer	HH3522019094	Spectrophotometric plate reader