تقنية الاستزراع في المختبر لدراسة الديناميكيات الخلوية في قشور أسماك الزرد

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لدراسة الديناميكيات الخلوية باستخدام تقنية بسيطة للثقافة في المختبر . يوفر فرصة للباحثين والمعلمين في أسماك الزرد لدراسة العمليات الخلوية ، مثل تلك المتعلقة بتوازن العظام وبيولوجيا الخلية الأساسية ، من خلال تصور النوى الفلورية والخلايا المبرمج داخل المقاييس.

Abstract

توفر قشور أسماك الزرد مجموعة متنوعة من المزايا للاستخدام في المختبرات القياسية لأغراض التدريس والبحث. يتم جمع المقاييس بسهولة دون الحاجة إلى القتل الرحيم ، وتتجدد في غضون أسبوعين ، وتكون شفافة وصغيرة ، مما يسمح بعرضها باستخدام مجهر قياسي. تعتبر قشور أسماك الزرد مفيدة بشكل خاص في البيئات التعليمية ، لأنها توفر فرصة فريدة للطلاب للمشاركة في خبرات التعلم العملي ، لا سيما في فهم الديناميكيات الخلوية وطرق الزراعة في المختبر . الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لجمع وصيانة قشور الزرد في الاستزراع لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية باستخدام معدات المختبرات الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح البروتوكول بالتفصيل استخدامها في فهم توازن العظام من خلال فحص نشاط خلايا العظام المشاركة في ارتشاف العظام وترسوبها. يتضمن أيضا بروتوكولات إضافية للتقنيات العامة ، مثل تصور النوى والخلايا المبرمجة. ينتج عن بروتوكول الزراعة في المختبر نتائج موثوقة مع الحد الأدنى من الكواشف والمعدات. تناقش هذه المقالة فوائد استخدام المزارع المختبرية لمقاييس أسماك الزرد لتعزيز البحث العلمي وتحدد الموارد اللازمة لدعم دمجها في البيئات التعليمية.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، برزت أسماك الزرد (Danio rerio) ككائن حي نموذجي قيم في مختلف المجالات العلمية ، بما في ذلك علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي وعلم السموم^1،2،3. أسماك الزرد هي أسماك مياه عذبة استوائية صغيرة موطنها أنهار جنوب شرق^{آسيا 4}. لقد أصبحوا كائنا نموذجيا شائعا في علم الأحياء نظرا لسهولة صيانتها وصغر حجمها ودورتها الإنجابية السريعة والأجنة الشفافة¹. هذا يسمح بمراقبة تطورها الداخلي بسهولة ، مما يجعلها مثالية لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في علم الأحياء التنموي. تشترك أسماك ال....

Protocol

تتبع جميع البروتوكولات الموضحة هنا إرشادات المجلس الكندي لرعاية وتمت الموافقة عليها سنويا من قبل لجنة رعاية بجامعة سانت ماري / جامعة ماونت سانت فنسنت بموجب البروتوكول رقم 20-14 و 21-12. قبل تنفيذ هذا البروتوكول ، يجب على المستخدمين التأكد من اتباع الإرشادات الفيدرالية والإقليمية بشأن استخدام في البحث أو^{التدريس 23}. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الكواشف لثقافة المقياس

1. تحضير وسط DMEM مع HEPES (10 جم من مسحوق DMEM ، 5.95 جم من HEPES ، في 1 لتر من الماء المقطر أو dH₂O ، درجة الحموضة: 6....

النتائج

في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بروتوكول الاستزراع المصغر هذا لدراسة توازن العظام¹¹. يمكن أن تعيش المقاييس في وسط الثقافة لمدة يومين على الأقل. تم تحليل أعداد الخلايا المبرمجة في كل يوم من أيام الاستزراع ، بحد أقصى ثلاثة أيام ، عن طريق حساب الخلايا المصنفة. أظ?.......

Discussion

قشور أسماك الزرد هي نموذج يسهل الوصول إليه في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية المختلفة التي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى يومين باستخدام طريقة الاستزراع وحاضنة لمحاكاة بيئتها الطبيعية¹¹. تحتوي المقاييس على توزيع منتظم ومتناسب للخ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer