JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لدراسة الديناميكيات الخلوية باستخدام تقنية بسيطة للثقافة في المختبر . يوفر فرصة للباحثين والمعلمين في أسماك الزرد لدراسة العمليات الخلوية ، مثل تلك المتعلقة بتوازن العظام وبيولوجيا الخلية الأساسية ، من خلال تصور النوى الفلورية والخلايا المبرمج داخل المقاييس.

Abstract

توفر قشور أسماك الزرد مجموعة متنوعة من المزايا للاستخدام في المختبرات القياسية لأغراض التدريس والبحث. يتم جمع المقاييس بسهولة دون الحاجة إلى القتل الرحيم ، وتتجدد في غضون أسبوعين ، وتكون شفافة وصغيرة ، مما يسمح بعرضها باستخدام مجهر قياسي. تعتبر قشور أسماك الزرد مفيدة بشكل خاص في البيئات التعليمية ، لأنها توفر فرصة فريدة للطلاب للمشاركة في خبرات التعلم العملي ، لا سيما في فهم الديناميكيات الخلوية وطرق الزراعة في المختبر . الهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو وصف طريقة لجمع وصيانة قشور الزرد في الاستزراع لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية باستخدام معدات المختبرات الأساسية. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح البروتوكول بالتفصيل استخدامها في فهم توازن العظام من خلال فحص نشاط خلايا العظام المشاركة في ارتشاف العظام وترسوبها. يتضمن أيضا بروتوكولات إضافية للتقنيات العامة ، مثل تصور النوى والخلايا المبرمجة. ينتج عن بروتوكول الزراعة في المختبر نتائج موثوقة مع الحد الأدنى من الكواشف والمعدات. تناقش هذه المقالة فوائد استخدام المزارع المختبرية لمقاييس أسماك الزرد لتعزيز البحث العلمي وتحدد الموارد اللازمة لدعم دمجها في البيئات التعليمية.

Introduction

في السنوات الأخيرة ، برزت أسماك الزرد (Danio rerio) ككائن حي نموذجي قيم في مختلف المجالات العلمية ، بما في ذلك علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي وعلم السموم1،2،3. أسماك الزرد هي أسماك مياه عذبة استوائية صغيرة موطنها أنهار جنوب شرقآسيا 4. لقد أصبحوا كائنا نموذجيا شائعا في علم الأحياء نظرا لسهولة صيانتها وصغر حجمها ودورتها الإنجابية السريعة والأجنة الشفافة1. هذا يسمح بمراقبة تطورها الداخلي بسهولة ، مما يجعلها مثالية لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في علم الأحياء التنموي. تشترك أسماك الزرد في أوجه التشابه الجيني مع البشر. ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية لها نظير واحد على الأقل من أسماك الزرد ، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة الاضطرابات والأمراض الوراثية لدى البشر5،6. من خلال التلاعب بجينات معينة في أسماك الزرد ، يمكن للباحثين اكتساب رؤى قيمة حول وظيفة وسلوك الجينات ، والتي يمكن تطبيقها بعد ذلك على أبحاث صحة الإنسان6 ، وتحرير الجينات ، وإنشاء خطوط معدلة وراثيا7،8.

تتجدد قشور الزرد بعد الإزالة9،10 ويمكن استزراعها لمدة يوم إلى ثلاثة أيام بحاضنة أساسية (غير ثاني أكسيدالكربون 2) أثناء استخدامها في التجارب11. يعد استخدام قشور الزرد مفيدا في المختبرات الأساسية حيث يمكن إزالتها من الأسماك المخدرة دون الحاجة إلى القتل الرحيم. قشور الزرد هي أحد مكونات الهيكل العظمي الجلدي ، وتتكون بشكل أساسي من طبقتين: الطبقة الداخلية ، وهي سميكة ومصنوعة من أنسجة معدنية جزئيا تتكون من طبقات من ألياف الكولاجين ، والطبقة الخارجية ، وهي عالية التمعدن وتحتوي على شبكة من ألياف الكولاجين المتشابكة12،13 (الشكل 1A-C). يمكن ملاحظة هذه السمات المورفولوجية والخلوية للمقياس بسهولة تحت المجهر المركب القياسي. هذه الخصائص تجعل قشور الزرد نموذجا جيدا لدراسة الخلايا والجزيئية. على سبيل المثال ، تم استخدام قشور الزرد لدراسة توازن العظام ، بما في ذلك نشاط خلايا العظام11،12. كما تم استخدامها لفهم تجديد الأنسجة9،14،15 ، ومسارات الجينات والإشارات14،16 ، والتمثيل الغذائي17 ، ودراسات الجراثيم18 ، إلخ. كما أن أسماك الزرد ، على غرار أنواع الزرد الأخرى ، حساسة للغاية للعوامل البيئية مثل الملوثات والسموم19،20،21،22. على هذا النحو ، تستخدم قشور الأسماك لدراسة التعرض للسموم في مجموعات الأسماك. هذه الخصائص تجعل المقاييس نموذجا ممتازا لتعليم الطلاب تأثيرات العوامل البيئية على الكائنات الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تضيف المقاييس من خطوط أسماك الزرد المعدلة وراثيا ، مثل Tg (osterix: mCherry) و Tg (runx2a: GFP) ، مستوى آخر من التعقيد إلى تجارب الطلاب.

باختصار ، باستخدام قشور الزرد ، يمكن للباحثين تصميم وإجراء تجارب لدراسة جوانب مختلفة من علم الأحياء ، من الآليات الخلوية إلى التغيرات البيئية. تعتبر أسماك الزرد أيضا مصدرا قيما في التعليم العالي لأنها يمكن أن توفر خبرات عملية في التصميم التجريبي وجمع البيانات والتحليل. يمكن أيضا استخدام أسماك الزرد في الدورات المتقدمة والبرامج التي تركز على البحث لاستكشاف مجالات اهتمام محددة. توضح هذه المقالة بروتوكولا لاستخدام قشور الزرد في بيئات البحث والتعلم في الفصول الدراسية.

Protocol

تتبع جميع البروتوكولات الموضحة هنا إرشادات المجلس الكندي لرعاية وتمت الموافقة عليها سنويا من قبل لجنة رعاية بجامعة سانت ماري / جامعة ماونت سانت فنسنت بموجب البروتوكول رقم 20-14 و 21-12. قبل تنفيذ هذا البروتوكول ، يجب على المستخدمين التأكد من اتباع الإرشادات الفيدرالية والإقليمية بشأن استخدام في البحث أوالتدريس 23. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الكواشف لثقافة المقياس

  1. تحضير وسط DMEM مع HEPES (10 جم من مسحوق DMEM ، 5.95 جم من HEPES ، في 1 لتر من الماء المقطر أو dH2O ، درجة الحموضة: 6.91) ، حسب الطلب ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  2. تحضير وسط الاستزراع - محلول العمل (88٪ وسط DMEM مع HEPES ، 10٪ مصل بقري للجنين ، و 2٪ بنسلين - ستربتومايسين [5000 وحدة بنسلين و 5 مجم ستربتومايسين لكل مل] معدلة حسب الحجم المطلوب في يوم إجراء التجربة.
    ملاحظة: يجب تحضير محلول العمل طازجا يوميا ولا يمكن تخزينه. يجب أن يظل وسط الاستزراع باردا (عند 4 درجات مئوية أو على الثلج) حتى استخدامه.
  3. قم بنقل محلول عمل وسط الثقافة في الحاويات التي ستجرى فيها التجربة. في هذه الحالة ، تم استخدام أنابيب 0.2 مل أو صفيحة 96 بئرا. احتفظ بهذه الحصص على الجليد لحين الحاجة.
    ملاحظة: يجب تحضير هذا المحلول طازجا ولا يمكن تخزينه لأكثر من يوم واحد. راجع الجدول 1 لجميع الكواشف.

2. إزالة القشور من الأسماك الحية

  1. قم بإعداد وعاء أو خزان لأسماك الزرد بحجم ماء يبلغ حوالي 2 لتر ل 4-5 أسماك بالغة.
    ملاحظة: المعلمات النموذجية للمياه المناسبة لأسماك الزرد هي درجة الحموضة 7.5 ، ودرجة الحرارة 28.5 درجة مئوية ، والموصلية 640-781 ميكرو ثانية ، ودورة الضوء الداكن 12-12 ساعة. تأكد من الحفاظ على درجة الحرارة باستمرار في الخزان.
  2. استخدم شبكة صيد لالتقاط 4-5 أسماك زرد بالغة وضعها في حوض حمل أسماك الزرد المحضر أعلاه.
  3. قم بإعداد وعاء به 60 مل على الأقل من الماء حيث سيتم تخدير الأسماك.
    ملاحظة: يجب أن تكون الأسماك قادرة على التحرك في الحاوية وأن تكون عميقة بما يكفي لمنعها من القفز. يجب أن تحتوي هذه الحاوية على 0.01٪ ثلاثي الميثان سلفونات (MS222) ، والتي يجب أن تتكون من ماء الزرد (مخفف 0.1٪ MS222 ، المحضر ب 0.3 جم من MS222 ، 615 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم في 300 مل من نظام مياه أسماك الزرد ، عشر مرات).
    تنبيه: يجب أن يحصل الأفراد الذين يجرون هذه التجارب على موافقة مجلس أخلاقيات المؤسسي لصيد أسماك الزرد وتخديرها والتعامل معها. وبالمثل ، فإن التخدير المستخدم هو تركيز منخفض من تريكاين ميثان سلفونات (MS222) ، وهي مادة كيميائية شائعة الاستخدام في بيولوجيا الأسماك ولكنها تتطلب معالجة مناسبة ، مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك قفازات النتريل التي تستخدم لمرة واحدة ، ونظارات السلامة / نظارات الرذاذ ومعطف المختبر (راجع ورقة بيانات السلامة الخاصة ب MS222 لمزيد من المعلومات).
  4. قم بإعداد حاوية استرداد بنفس المواصفات المستخدمة سابقا في الخطوة 1 (2 لتر على الأقل من الماء) حيث سيتم وضع الأسماك بعد إزالة القشرة. يجب أن تحتوي هذه الحاوية على مساحة كافية ومعلمات المياه الصحيحة ، كما هو مذكور أعلاه.
  5. باستخدام شبكة ، انقل سمكة زرد واحدة بالغة بعناية إلى الحاوية التي تحتوي على 0.01٪ MS222. انتظر حتى تصبح السمكة غير متحركة تماما ولديها الحد الأدنى من الحركة التشغيلية (يستغرق هذا عادة أقل من 10 دقائق).
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة بأكملها سمكة واحدة في كل مرة. لا تخدير السمكة التالية حتى تتم إزالة القشور بنجاح من الأسماك التي يتم التعامل معها وحتى يتم نقل تلك السمكة إلى حاوية الاسترداد.
  6. ضع سمك الزرد البالغ بشكل فردي على طبق بتري مقلوب مبطن بمنشفة ورقية مبللة.
  7. تحت مجهر مجسمة تشريح وباستخدام ملقط دقيق ، قم بإزالة 10-12 قشور كحد أقصى من سمكة فردية. تتم إزالة المقاييس من المنطقة الجانبية للأسماك ، حيث تكون المقاييس أكبر ولها حجم أكثر ثباتا مقارنة بأجزاء الجسم الأخرى (الشكل 2). يمكن استخدام جانبي السمكة.
    1. قم بإزالة المقاييس واحدة تلو الأخرى عن طريق السحب برفق في الاتجاه الطبيعي للمقياس (أي في الاتجاه من الأمام إلى الخلف). يجب أن يتم ذلك في أسرع وقت ممكن.
  8. ضع كل مقياس فردي في أنبوب منفصل سعة 0.2 مل يحتوي على محلول متوسط عمل ثقافة الترسبات الكلسية (المحضر في الخطوة 1.1) لمنع المقاييس من التدهور. يمكن استخدام صفيحة 96 بئرا كبديل.
    ملاحظة: يمنع عزل المقاييس الفردية في أنابيب أو آبار منفصلة المقاييس من الالتصاق ببعضها البعض ويسمح بتتبع المقاييس الفردية التي قد تكون مطلوبة لتجارب متعددة.
  9. إذا كانت التجربة المحددة تتطلب علاجا على نطاق واسع ، فقم بتطبيقه في هذه الخطوة. للحصول على أمثلة على بعض البروتوكولات، يرجى الرجوع إلى الخطوتين 4 و5.
  10. ضع الأنابيب ذات المقاييس داخل حاضنة عند 28 درجة مئوية. يجب تغيير وسط الاستزراع كل 24 ساعة (مع حل الاستزراع المتوسط). تم استخدام حاضنة غير ثاني أكسيد الكربون2 للتجارب الموضحة هنا.
  11. بعد إزالة الترسبات الكلسية ، أعد سمكة الزرد بعناية إلى خزان الاسترداد وراقبها حتى تستأنف الحركة. يتم استخدام ماصة أو حجر تهوية لتوفير الهواء في الخزان لتسريع الاسترداد.
  12. بمجرد استعادة الحركة ، أعد سمك الزرد إلى حوض تربية منتظم. تذكر أن تحتفظ بالأسماك التي تم استخدامها بشكل منفصل عن أي سمكة أخرى حتى تتمكن من التعافي بشكل منفصل وتتبع الأسماك التي تجدد قشورها بنشاط.
  13. انتظر ~ 2 أسابيع قبل تكرار إزالة الترسبات الكلسية من هذه الأسماك نفسها. هذا يتيح لهم الوقت لتجديد مقاييسهم بشكل طبيعي.

3. تثبيت المقاييس

  1. اغسل المقاييس ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من 1x من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) المحضر من 10x PBS (ل 1 لتر ، أضف 80 جم من كلوريد الصوديوم ، و 2 جم من KCl ، و 11.2 جم من Na2HPO4 ، أضف dH2O حتى 1 لتر).
  2. قم بإزالة 1x PBS وأضف 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. للحصول على 100 مل من PFA ، أضف 4 جم من بارافورمالدهيد و 0.1 جم من هيدروكسيد الصوديوم ، ثم أضف 1x PBS حتى 100 مل. اخلطيهم على طبق ساخن على نار خفيفة وقلبي حتى يصبح المحلول صافيا ، ثم اتركي المحلول يبرد وثبت الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. يحفظ في -20 درجة مئوية. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 1).
  3. بعد التثبيت ، اغسل المقاييس ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من 1x PBS. قم بتخزين الموازين عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: PFA ضار. راجع ورقة بيانات السلامة لمزيد من المعلومات. تتطلب كل هذه العمليات معالجة مناسبة ، مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك قفازات النتريل التي تستخدم لمرة واحدة ، ونظارات السلامة / نظارات الرذاذ ، ومعطف المختبر.

4. توازن العظام

ملاحظة: يتم وصف إجراءين لتوازن العظام أدناه. عادة ما يستخدم تلطيخ الفوسفاتيز الحمضي المقاوم للطرطرات (TRAP) والفوسفات القلوي (AP) لتحديد ناقضات العظم النشطة وبانيات العظم ، على التوالي. تمتص ناقضات العظام مصفوفة العظام بينما تودع بانيات العظم مصفوفة العظام. AP هو الإنزيم الرئيسي الذي تطلقه بانيات العظم أثناء تكوين العظام ، بينما يتم إفراز TRAP بواسطة ناقضات العظم في الفراغ الحمضي بين ناقضات العظم ومصفوفة العظام ، مما يساعد في انهيار العظام والارتشاف24،25،26. هذا البروتوكول متاح أيضا على شبكة معلومات أسماكالزرد 27وقد تم نشره سابقافي 28. الفوسفاتيز القلوي هو إنزيم تنتجه أنواع متعددة من الخلايا كجزء من عملية التمثيل الغذائي. هذه العملية ليست خاصة تماما بانيات العظم ، ولكن في أنسجة العظام ، يتم استخدامها كعلامة لوظيفة بانيات العظم.

  1. تلطيخ حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP)
    1. ضع كل مقياس ثابت في أنبوب سعة 0.2 مل أو صفيحة سعة 96 بئرا مع 200 ميكرولتر من dH2O. اغسل المقاييس عن طريق إضافة وإزالة حوالي 150 ميكرولتر من dH2O لمدة 15 دقيقة ثلاث مرات. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 2).
    2. قم بإزالة القشور من أنبوب 0.2 مل أو بئر وضعها في أنبوب جديد يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول طرطرات 50 ملم. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      1. للحصول على 100 ملي مولار من المخزن المؤقت للطرطرات ، قم بإعداد وعاء زجاجي ، وأضف 2.3 جم من حمض الطرطريك ، واخلطه مع 0.2 متر من الأسيتات (درجة الحموضة 5.5) حتى 100 مل من المحلول. يقلب جيدا ويخزن على حرارة 4 درجات مئوية. لتحضير 50 ملي مولار من المخزن المؤقت للطرطرات ، أضف كميات متساوية من dH2O و 100 mM عازلة طرطرات. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 3 والجدول 4).
    3. قم بإزالة عازلة الطرطرات من الأنبوب وأضف 200 ميكرولتر من محلول الركيزة TRAP. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بقاء العينات في الظلام.
      1. قم بإعداد وعاء زجاجي داكن وأضف 30 مل من محلول طرطرات 100 ملي مولار ، و 1 مل من PRS سداسي الازوتات (محلول هيدروكلوريد باراروزانيلين) ، و 2 مل من محلول ركيزة الإنزيم. يقلب جيدا.
        ملاحظة: لا يمكن تخزين هذا الحل. احتفظ بها في الظلام في درجة حرارة الغرفة أثناء الاستخدام. للحصول على الحلول اللازمة لإعداد محلول الركيزة TRAP ، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجداول 5-9).
    4. قم بإزالة محلول الركيزة TRAP واغسل المقاييس عن طريق إضافة وإزالة حوالي 150 ميكرولتر من dH2O لمدة 15 دقيقة ، ثلاث مرات.
    5. قم بإزالة المقاييس من الأنبوب وضعها في أنبوب جديد أو بئر مع 200 ميكرولتر من 80٪ جلسرين (ل 100 مل ، امزج 80 مل من الجلسرين مع 20 مل من dH2O) ملفوفة بورق الألمنيوم لتجنب التلاشي وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
    6. لتصور المقاييس تحت المجهر ، استخدم شريحة منخفضة أو مقعرة.
  2. تلطيخ الفوسفات القلوي (AP)
    1. ضع كل مقياس ثابت في أنبوب 0.2 مل أو صفيحة 96 بئرا مع 200 ميكرولتر من dH2O واغسلها عن طريق إضافة وإزالة حوالي 150 ميكرولتر من dH2O لمدة 15 دقيقة ، ثلاث مرات. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 2).
    2. قم بإزالة المقاييس من الأنابيب أو الآبار سعة 0.2 مل وضعها في أنبوب جديد يحتوي على 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت tris-maleate واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
      1. لهذا المخزن المؤقت ، قم بإعداد وعاء زجاجي وأضف 0.605 جم من عازلة تريس و 0.55 جم من حمض الماليك. يضاف dH2O حتى 25 مل ويقلب جيدا. استقر إلى درجة الحموضة 8.3. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 10).
    3. قم بإزالة المخزن المؤقت tris-maleate من الأنبوب وأضف 200 ميكرولتر من محلول الركيزة AP. احتضنها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من بقاء العينات في الظلام.
      1. لهذا المحلول ، قم بإعداد وعاء زجاجي داكن ، وأضف 8 مجم من ملح الديازونيوم ، واخلطه مع 0.1 مل من فوسفات النبثول AS-TR في N و N-dimethylformamide و 10 مل من المخزن المؤقت tris-maleate (درجة الحموضة 8.3) ، وحركه جيدا. تحضير هذا الحل طازجا. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الاطلاع على الملف التكميلي 1 (الجدول 11).
    4. قم بإزالة محلول الركيزة AP واغسل المقاييس عن طريق إضافة وإزالة 200 ميكرولتر من dH2O لمدة 15 دقيقة ، ثلاث مرات.
    5. قم بإزالة المقاييس من الأنبوب وضعها في أنبوب جديد أو بئر مع 200 ميكرولتر من 80٪ جلسرين ملفوفة بورق الألمنيوم لتجنب التلاشي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    6. لتصور المقاييس باستخدام المجهر ، ضع المقاييس على شريحة مقعرة أو اكتئابية.
      تنبيه: يمكن أن تكون معظم الكواشف المستخدمة في تلطيخ TRAP و AP ضارة. راجع ورقة بيانات السلامة لكل مادة كيميائية. تتطلب كل هذه الإجراءات التعامل السليم ، مثل معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك قفازات النتريل التي تستخدم لمرة واحدة ، ونظارات السلامة / نظارات الرذاذ ، ومعطف المختبر.

5. تصور ديناميكيات الخلية في قشور الزرد

ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة من طرق التلوين لتصور الاختلافات بين المقاييس وتسمية الخلايا داخل المقياس (الشكل 3 ب). على سبيل المثال ، يتم توضيح طرق تلطيخ النوى والجسيمات الحالة داخل خلايا المقياس أدناه.

  1. تلطيخ DAPI لتصور نوى الخلية
    ملاحظة: يستخدم DAPI لتمييز نوى جميع الخلايا عن طريق تسمية الحمض النووي. DAPI هي علامة فلورية ترتبط بقوة بالمناطق المخصبة للأدينين والثايمين في تسلسل الحمض النووي.
    1. قبل استخدام DAPI ، تأكد من تثبيت المقاييس في 4٪ بارافورمالدهيد (الخطوة 3). اغسل المقاييس ب 200 ميكرولتر 1x PBS لمدة 5 دقائق بعد التثبيت.
    2. قم بإعداد حل عمل DAPI في تخفيف 1:10 على النحو التالي. امزج 1 ميكرولتر من DAPI مع 9 ميكرولتر من 1x PBS لتكوين حجم إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر.
    3. بعد تحضير محلول DAPI ، استخدم ملقطا أو ماصة بلاستيكية لوضع الميزان على شريحة مقعرة ، وإزالة PBS الزائد ، وإضافة حوالي 10 ميكرولتر من محلول DAPI المحضر.
      ملاحظة: سيقوم DAPI بتلطيخ المقياس على الفور ، بحيث يمكن تصوره باستخدام مجهر مضان بطول موجي إثارة يبلغ 352-402 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 417-477 نانومتر. سوف يلطخ DAPI جميع نوى الخلايا بلون أزرق فاتح. من أجل رؤية المقياس بأكمله في مجال الرؤية ، تم استخدام هدف 4x. تظهر النوى الملونة المفردة باستخدام هدف 20x.
    4. احسب عدد النوى الملطخة ب DAPI لتحديد عدد الخلايا في المقياس.
  2. تلطيخ موت الخلايا المبرمج لتصور موت الخلايا في العينات الحية
    ملاحظة: يمكن استخدام بقع الفلورسنت لتسمية الخلايا المبرمجة. على سبيل المثال ، بروتوكول علامة التألق المستخدم هنا مخصص للبيئات الحمضية ويمكن استخدامه لوضع العلامات على العضيات الحمضية وتتبعها مثل الجسيمات الحالة. ترتبط الزيادة في عدد هذه العضيات بزيادة موت الخلايا. يجب تطبيق هذه البقعة على المقاييس غير الثابتة التي يتم سحبها حديثا أو تم زراعتها لمدة تصل إلى يومين.
    1. قم بإعداد محلول من صبغة الفلورسنت لتتبع موت الخلايا المبرمج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام وسيط الثقافة كمخفف.
      ملاحظة: يمكن أن يتغير تركيز صبغة الفلورسنت بشكل كبير اعتمادا على طريقة موت الخلايا المبرمج المستخدمة. راجع البروتوكول التجاري للبقعة المفضلة للحصول على تفاصيل محددة حول التركيزات الموصى بها.
    2. قم بإزالة وسط الاستزراع بعناية من كل أنبوب سعة 0.2 مل أو بئر من صفيحة 96 بئرا إذا كانت المقاييس مستزرعة مسبقا.
    3. أضف ما يكفي من محلول تلطيخ الفلورسنت لتغطية المقياس بالكامل (حوالي 50 ميكرولتر).
    4. قم بتغطية جميع الأنابيب بورق الألمنيوم لتجنب البهتان واتركها لمدة 30 دقيقة.
    5. قم بإزالة محلول تلطيخ الفلورسنت من الأنابيب أو الآبار.
    6. اغسل العينات بإضافة 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنابيب أو الآبار لمدة 5 دقائق.
    7. قم بإزالة PBS وأضف 200 ميكرولتر من 4٪ PFA إلى الأنابيب أو الآبار لإصلاح العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    8. اغسل العينات بإضافة 200 ميكرولتر 1x PBS إلى الأنابيب أو الآبار لمدة 5 دقائق.
    9. انقل المقاييس إلى أنبوب جديد سعة 0.2 مل أو بئر ، وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS الطازج. قم بتغطية هذه الأنابيب / الآبار بورق الألمنيوم لتجنب التلاشي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    10. لتصور المقاييس باستخدام مجهر مضان ، استخدم شريحة مقعرة أو اكتئابية ، والمرشح الصحيح. إشارة الفلورسنت المستخدمة هنا لها حد أقصى للإثارة والانبعاث يبلغ 577-590 نانومتر. تظهر البقعة الفلورية خلايا موت الخلايا المبرمج التي تحتوي على الجسيمات الحالة باللون الأحمر.
    11. احسب عدد الخلايا الملطخة لتحديد عدد الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج.
      ملاحظة: يتم استخدام رقائق الألومنيوم أثناء التلوين والتخزين لتجنب البهتان. يمكن تخزين العينات في الظلام لبضع ساعات أو حتى أيام ، اعتمادا على صبغة الفلورسنت المستخدمة. لتخزين عينات الفلورسنت لفترات أطول ، استخدم بروتوكول التثبيت والتركيب المتوافق مع صبغة الفلورسنت. تم تصور جميع تلطيخ الفلورسنت باستخدام مجهر مضان بتكبير 20 ضعفا على الأقل. كان المرشح المستخدم على النحو التالي: ل DAPI 417-477 نانومتر ؛ لتتبع موت الخلايا المبرمج 577-590 نانومتر.

النتائج

في الآونة الأخيرة ، تم استخدام بروتوكول الاستزراع المصغر هذا لدراسة توازن العظام11. يمكن أن تعيش المقاييس في وسط الثقافة لمدة يومين على الأقل. تم تحليل أعداد الخلايا المبرمجة في كل يوم من أيام الاستزراع ، بحد أقصى ثلاثة أيام ، عن طريق حساب الخلايا المصنفة. أظ?...

Discussion

قشور أسماك الزرد هي نموذج يسهل الوصول إليه في المختبر لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية المختلفة التي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى يومين باستخدام طريقة الاستزراع وحاضنة لمحاكاة بيئتها الطبيعية11. تحتوي المقاييس على توزيع منتظم ومتناسب للخ...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون موظفي المنشأة المائية بجامعة ماونت سانت فنسنت وجميع أعضاء مختبر فرانز أوديندال لتنمية العظام على توفير الرعاية اللازمة للأسماك. شكر خاص لأليشا ماكنيل وكيلي أ. ماكليلان وشيرين جرادي للمساعدة في تحسين بعض البروتوكولات. تم دعم هذا البحث بتمويل من وكالة الفضاء الكندية (CSA) [19HLSRM01] ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL tubesn/an/a
37% HCl EMDHX0603-4For pH stabilization and prepration of PRS
Concave sliden/an/a
DAPIVectashieldH-1200For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)SigmaD9805For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder Sigma D5523For scale culture media 
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222) Sigma E10521For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum Sigma F4135For scale culture media 
Fluorescence microscopen/an/a
Glacial acetic acid Fisher A38 212For acetate buffer
GlycerolVWRBDH1172-4LPFor 80% glycerol - storage scales
HEPES ThermoFisher 15630106For scale culture media 
Hot platen/an/a
KCl SigmaP217-10For preparation of PBS
LysotrackerThermoFisherL7528For lysosomes  visualization
Maleic acidSigmaM0375For Tris-Maleate buffer 
Micropipetten/an/a
N,N-dimethylformamideSigma319937For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide Sigma319937For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4 EMDSX0720-1For preparation of PBS
NaCl Sigma S9888For preparation of PBS
NaNO2SigmaS-2252For 4% NaNO2
NaOH SigmaS5881For preparation of 4% PFA
NaOH Sigma S5881For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphateSigmaN6125For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate SigmaN6125For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride SigmaP3750For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/mlThermoFisher 15140122For scale culture media 
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.n/an/a
PFA Sigma P6148For scale fixation
Sodium acetate Sigma S2889For acetate buffer
Standard compound microscopen/an/a
Stir platen/an/a
Tartaric acidSigmaT6521For Tartrate buffer
Tris baseRoche03 118 142 001For Tris-Maleate buffer 

References

  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
  2. Linney, E., Upchurch, L., Donerly, S. Zebrafish as a neurotoxicological model. Neurotoxicol Teratol. 26 (6), 709-718 (2004).
  3. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Drug Safety Eval: Met Prot. , 271-279 (2011).
  4. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  5. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  6. Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods Cell Biol. 105, 309-337 (2011).
  7. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Anim Res. 37, 1-29 (2021).
  8. Brito, R. S., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Sci Total Environ. 848, 157665 (2022).
  9. Bergen, D. J. M., et al. Regenerating zebrafish scales express a subset of evolutionary conserved genes involved in human skeletal disease. BMC Biol. 20 (1), 1-25 (2022).
  10. Sire, J., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (Cyprinidae), using scale regeneration. J Exp Zool. 286 (3), 297-304 (2000).
  11. Carvajal-Agudelo, J. D., McNeil, A., Franz-Odendaal, T. A. Effects of simulated microgravity and vibration on osteoblast and osteoclast activity in cultured zebrafish scales. Life Sci Space Res. 38, 39-45 (2023).
  12. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. Osteoblast and osteoclast behavior in zebrafish cultured scales. Cell Tissue Res. 350, 69-75 (2012).
  13. Pasqualetti, S., Banfi, G., Mariotti, M. The zebrafish scale as model to study the bone mineralization process. J Mol Histol. 43, 589-595 (2012).
  14. De Vrieze, E., et al. Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales. Osteoporos Int. 25, 567-578 (2014).
  15. Iwasaki, M., Kuroda, J., Kawakami, K., Wada, H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 437 (2), 105-119 (2018).
  16. Aman, A. J., Fulbright, A. N., Parichy, D. M. Wnt/β-catenin regulates an ancient signaling network during zebrafish scale development. Elife. 7, e37001 (2018).
  17. Carnovali, M., Luzi, L., Banfi, G., Mariotti, M. Chronic hyperglycemia affects bone metabolism in adult zebrafish scale model. Endocr. 54, 808-817 (2016).
  18. Burns, A. R., Guillemin, K. The scales of the zebrafish: Host-microbiota interactions from proteins to populations. COMICR. 38, 137-141 (2017).
  19. Vieira, E. F. S., et al. The use of freshwater fish scale of the species Leporinus elongatus as adsorbent for anionic dyes: An isothermal calorimetric study. J Therm Anal Calorim. 109 (3), 1407-1412 (2012).
  20. Ighalo, J. O., Eletta, O. A. A. Recent advances in the biosorption of pollutants by fish scales: A mini-review. Chem Eng Commun. 208 (9), 1301-1312 (2021).
  21. Eletta, O. A. A., Ighalo, J. O. A review of fish scales as a source of biosorbent for the removal of pollutants from industrial effluents. J Res Inf Civ Eng. 16 (1), 2479-2510 (2019).
  22. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci. 86 (1), 6-19 (2005).
  23. . CCAC Canadian Council of Animal Care (CCAC) Available from: https://ccac.ca/ (2024)
  24. Suzuki, N., Hattori, A. Melatonin suppresses osteoclastic and osteoblastic activities in the scales of goldfish. J. Pineal Res. 33 (4), 253-258 (2002).
  25. Suzuki, N., et al. Effect of vibration on osteoblastic and osteoclastic activities: Analysis of bone metabolism using goldfish scale as a model for bone. ASR. 40 (11), 1711-1721 (2007).
  26. Kawakami, K., et al. z Trap: zebrafish gene trap and enhancer trap database. BMC Dev Biol. 10, 1-10 (2010).
  27. . ZFIN The Zebrafish Model Organism Database. Available from: https://zfin.org/ (2024)
  28. Edsall, S. C., Franz-Odendaal, T. A. A quick whole-mount staining protocol for bone deposition and resorption. Zebrafish. 7 (3), 275-280 (2010).
  29. Howe, D. G., et al. the Zebrafish Model Organism Database: Increased support for mutants and transgenics. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D854-D860 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, Danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  31. Barresi, M. J., et al. Zebrafish in the Classroom. Zebrafish. 5 (3), 205-208 (2008).
  32. Ghods, S., et al. On the regeneration of fish scales: Structure and mechanical behavior. J Exp Biol. 223 (10), jeb211144 (2020).
  33. Krishnan, S., Sekar, S., Katheem, M. F., Krishnakumar, S., Sastry, T. P. Fish scale collagen-A novel material for corneal tissue engineering. Artif Organs. 36 (9), 829-835 (2012).
  34. Zhao, S., et al. A novel porous nanocomposite of sulfur/carbon obtained from fish scales for lithium-sulfur batteries. J Mater Chem. 1 (10), 3334-3339 (2013).
  35. Kumar, R., et al. A noninvasive technique for rapid extraction of DNA from fish scales. IJEB. 45 (11), 992-999 (2007).
  36. Hutchinson, J. J., Trueman, C. N. Stable isotope analyses of collagen in fish scales: Limitations set by scale architecture. J Fish Biol. 69 (6), 1874-1880 (2006).
  37. Kumari, S., Rath, P. K. Extraction and characterization of chitin and chitosan from (Labeo rohit) fish scales. Procedia Mater Sci. 6, 482-489 (2014).
  38. Stepnowski, P., Ólafsson, G., Helgason, H., Jastorff, B. Preliminary study on chemical and physical principles of astaxanthin sorption to fish scales towards applicability in fisheries waste management. Aquac. 232 (1-4), 293-303 (2004).
  39. Ghods, S., Murcia, S., Ossa, E. A., Arola, D. Designed for resistance to puncture: The dynamic response of fish scales. J Mech Behav Biomed Mater. 90, 451-459 (2019).
  40. Yang, W., et al. Protective role of Arapaima gigas fish scales: Structure and mechanical behavior. Acta Biomater. 10 (8), 3599-3614 (2014).
  41. Zhu, D., Zhang, C., Liu, P., Jawad, L. A. Comparison of the morphology, structures and mechanical properties of teleost fish scales collected from New Zealand. J. Bionic Eng. 16, 328-336 (2019).
  42. Witzmann, F. Morphological and histological changes of dermal scales during the fish-to-tetrapod transition. Acta Zool. 92 (3), 281-302 (2011).
  43. Ibañez, A. L., Cowx, I. G., O'Higgins, P. Geometric morphometric analysis of fish scales for identifying genera, species, and local populations within the Mugilidae. Can J Fish Aquat Sci. 64 (8), 1091-1100 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved