بناء شبكات التمثيل الغذائي خارج التوازن في حويصلات بحجم النانو والميكرومتر

Summary

نقدم بروتوكولا لإعادة تكوين بروتينات الغشاء وتغليف الإنزيمات والمكونات الأخرى القابلة للذوبان في الماء في حويصلات دهنية بحجم دون ميكرومتر وميكرومتر.

Abstract

نقدم طريقة لدمج شبكات البروتين المعقدة في الحويصلات ، والتي تتضمن بروتينات غشائية متكاملة ، وإنزيمات ، وأجهزة استشعار قائمة على التألق ، باستخدام مكونات منقاة. هذه الطريقة مناسبة لتصميم وبناء المفاعلات الحيوية ودراسة شبكات التفاعل الأيضي المعقدة خارج التوازن. نبدأ بإعادة تكوين بروتينات غشائية (متعددة) إلى حويصلات كبيرة أحادية الصفيحة (LUVs) وفقا لبروتوكول تم تطويره مسبقا. ثم نقوم بتغليف خليط من الإنزيمات المنقاة والمستقلبات وأجهزة الاستشعار القائمة على التألق (البروتينات أو الأصباغ الفلورية) عن طريق التجميد والذوبان والبثق وإزالة المكونات غير المدمجة عن طريق الطرد المركزي و / أو كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. يتم قياس أداء الشبكات الأيضية في الوقت الفعلي من خلال مراقبة نسبة ATP / ADP أو تركيز المستقلب أو الأس الهيدروجيني الداخلي أو المعلمات الأخرى عن طريق قراءات مضان. يمكن تحويل حويصلاتنا الغشائية المحتوية على البروتين بقطر 100-400 نانومتر إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) ، باستخدام الإجراءات الحالية ولكن المحسنة. يتيح هذا النهج إدراج المكونات القابلة للذوبان (الإنزيمات والمستقلبات وأجهزة الاستشعار) في حويصلات بحجم ميكرومتر ، وبالتالي زيادة حجم المفاعلات الحيوية بأوامر من حيث الحجم. يتم احتجاز الشبكة الأيضية التي تحتوي على GUVs في أجهزة الموائع الدقيقة لتحليلها بواسطة المجهر الضوئي.

Introduction

يركز مجال البيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى على بناء الخلايا (الحد الأدنى) ^1,2 والمفاعلات الحيوية الأيضية للتكنولوجيا الحيوية ^3,4 أو الأغراض الطبية الحيوية ^5,6,7,8. يوفر بناء الخلايا الاصطناعية منصة فريدة تسمح للباحثين بدراسة البروتينات (الغشائية) في ظروف محددة جيدا تحاكي تلك الموجودة في البيئات الأصلية ، مما يتيح اكتشاف الخصائص الناشئة والوظائف الكيميائية الحيوية المخفية للبروتينات وشبكات التفاعل

Protocol

1. الإعداد العام

1. المواد الكيميائيه
   1. قم بإذابة الدهون (في شكل مسحوق) إلى 25 مجم / مل في CHCl₃ لصنع الجسيمات الشحمية المشكلة مسبقا.
      ملاحظة: يفضل تحضير مخزون الدهون الطازج ، ولكن يمكن أيضا تخزين محاليل المخزون عند -20 درجة مئوية لبضعة أسابيع. العمل مع الدهون في شكل مسحوق أكثر دقة من استخدام الدهون القابلة للذوبان بالفعل في CHCl₃. يجب التعامل مع CHCl₃ باستخدام ماصات زجاجية و / أو محاقن وتخزينها في عبوات زجاجية لأن CHCl₃ يذيب البلاستيك.
   2. قم بإذابة الجزيئات الصغيرة (النيوكليوتيدات ، الأحماض الأمينية ، مجسات التألق) لإجراء التغليف في 50 mM KPi (المخزن المؤقت A ، انظر الجدول 1

النتائج

تتطلب إعادة تكوين البروتينات الغشائية القابلة للذوبان في الجسيمات الشحمية زعزعة استقرار الحويصلات المشكلة مسبقا. تؤدي إضافة كميات منخفضة من Triton X-100 في البداية إلى زيادة الامتصاص عند 540 نانومتر (A₅₄₀) بسبب زيادة تشتت الضوء بسبب تورم الحويصلات (الشكل 4). الحد الأقصى لقيمة.......

Discussion

نقدم بروتوكولا لتخليق البروتين (الغشائي) الذي يحتوي على حويصلات دهنية بحجم أقل من ميكرومتر (proteoLUVs) ، وتحويل البروتينات LUVs إلى حويصلات عملاقة أحادية الصفيحة (proteoGUVs). يجب أن يكون البروتوكول قابلا للتطبيق لإعادة تكوين البروتينات الغشائية الأخرى^13،19،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g