JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتحضير النسيجي للشرائح من مقل عيون القوارض. باستخدام الطريقة المقترحة ، يمكن تصور شبكية العين الداخلية وتقييمها بسهولة تحت المجهر الضوئي. يتم تقديم الإجراء لمقل عيون الفئران والجرذان.

Abstract

مقلة عين القوارض هي أداة قوية للبحث عن الآليات المرضية للعديد من أمراض العيون ، مثل الجلوكوما واعتلال الشبكية بارتفاع ضغط الدم وغيرها الكثير. تمكن التجارب قبل السريرية الباحثين من فحص فعالية الأدوية الجديدة ، أو تطوير طرق جديدة للعلاج ، أو البحث عن آليات مرضية جديدة تشارك في ظهور المرض أو تطوره. يوفر الفحص النسيجي الكثير من المعلومات اللازمة لتقييم آثار التجارب التي تم إجراؤها ويمكن أن يكشف عن التنكس وإعادة تشكيل الأنسجة والتسلل والعديد من الأمراض الأخرى. في الأبحاث السريرية ، نادرا ما تكون هناك أي فرصة للحصول على أنسجة العين المناسبة للفحص النسيجي ، ولهذا السبب يجب على الباحثين الاستفادة من الفرصة التي يوفرها فحص مقل العيون من القوارض. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتحضير النسيجي لأقسام مقل عيون القوارض. يتم تقديم الإجراء لمقل عيون الفئران والجرذان وله الخطوات التالية: (أنا) حصاد مقلة العين ، (ثانيا) الحفاظ على مقلة العين لمزيد من التحليل ، (ثالثا) معالجة الأنسجة في البارافين ، (رابعا) تحضير الشرائح ، (ت) تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين ، (سادسا) تقييم الأنسجة تحت المجهر الضوئي. باستخدام الطريقة المقترحة ، يمكن تصور شبكية العين بسهولة وتقييمها بالتفصيل.

Introduction

مقلة العين عبارة عن هيكل يشبه الكرة الأرضية يشكل جهاز البصر. يمكن تقسيم الجزء الداخلي من مقلة العين إلى جزأين: الجزء الأمامي ، والذي يشمل القرنية ، والقزحية ، والجسم الهدبي ، والعدسة ، والغرفة الأمامية ، والغرفة الخلفية ، والجزء الخلفي ، والذي يشمل الجسم الزجاجي ، شبكية العين ، المشيمية ، الصلبة ، رأس العصب البصري. تقع الغرفة الأمامية بين القرنية والقزحية1،2. القزحية عبارة عن هيكل دائري به فتحة في الوسط تسمى التلميذ. عند تقاطع القرنية والقزحية ، توجد زاوية التصريف ، حيث يقوم نظام متخصص من التربيق بتصريف الخلط المائي من مقلة العين إلى الجهاز الوريدي. ترتبط الغرفة الخلفية بالقزحية والجسم الهدبي والعدسة ، بالإضافة إلى الأربطة المعلقة التي تثبت العدسة في مكانها. خلف العدسة ، يوجد الجسم الزجاجي ، وهو أكبر هيكل لمقلة العين. يلتصق الجسم الزجاجي بشبكية العين ويثبت موضعه. شبكية العين محاطة بالمشيمية والصلبة1. يتم تلخيص تشريح مقلة العين في الشكل 1.

يتكون جدار مقلة العين من ثلاث طبقات. الطبقة الخارجية هي الصلبة التي تحمي مقلة العين من الإصابة وتحافظ على شكلها. في القطب الأمامي لمقلة العين ، تتحول الصلبة إلى قرنية شفافة. تحت الصلبة ، يوجد هيكل وعائي يسمى القزحية ، وتتمثل وظيفتها الأساسية في تغذية هياكل العين. يشكل العنبية المشيمية ، وداخل القطب الأمامي ، الجسم الهدبي والقزحية1. الطبقة الأعمق هي شبكية العين ، وهي بنية عالية التخصص للعين ، تتكون من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية والخلايا الظهارية الصباغية. تشمل الخلايا العصبية في الشبكية الخلايا المستقبلة للضوء (القضبان والأقماع) والخلايا الأفقية والخلايا ثنائية القطب وخلايا amacrine والخلايا العقدية الشبكية (RGCs). يتم تنظيم هذه الخلايا في طبقات معقدة ، ويتمثل دورها في تلقي ومعالجة محفزات الضوء2،3. تتكون الخلايا الدبقية في شبكية العين من خلايا مولر والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة الموجودة في جميع طبقات شبكية العين. تشمل الوظائف العديدة للخلايا الدبقية تغذية الخلايا العصبية ، ودعم حاجز الشبكية الدموية ، والدعم الهيكلي للخلايا العصبية للحفاظ على البنية الطبقية لشبكية العين ، وتنظيم عملية التمثيل الغذائي للخلايا العصبية ، وإفراز البروتينات النشطة بيولوجيا التي تنظم أداء الخلايا العصبية ونموها وبقائها ، وتنظيم العمليات المناعية داخل شبكيةالعين 4. تشكل الخلايا الظهارية الصبغية الطبقة الخارجية من شبكية العين وتعمل كحاجز بين المشيمية والمستقبلات الضوئية. تنظم هذه الخلايا النقل ثنائي الاتجاه للنفايات والمواد المغذية وتحمي شبكية العين أيضا من التلف المفرط الناجم عن الضوء عن طريق امتصاص الطاقة الضوئية وتحييد أنواع الأكسجين التفاعلي الناتجة عن الضوء5.

يمكن تقسيم شبكية العين إلى عشر طبقات: (أنا) ظهارة صبغة الشبكية ، (ثانيا) طبقة الجزء المستقبلة للضوء (القضبان والأقماع) ، (ثالثا) الغشاء المحدد الخارجي (ELM) ، (رابعا) الطبقة النووية الخارجية (ONL) ، (الخامس) الطبقة الخارجية الضفيرية (OPL) ، (السادس) الطبقة النووية الداخلية (INL) ، (السابع) طبقة الضفيرة الداخلية (IPL) ، (ثامنا) طبقة الخلية العقدية (GCL) ، (التاسع) طبقة الألياف العصبية الشبكية (RNFL) ، و (خ) الغشاء المحدد الداخلي (ILM) 2. تشمل الطبقات المنواة لشبكية العين ONL و INL و GCL ، بينما تشمل الطبقات ذات الوصلات المشبكية بين الخلايا OPL و IPL6. تشكل نوى القضبان والأقماع ONL ، وتمتد محاورها إلى OPL ، حيث تتصل بتشعبات الخلايا ثنائية القطب والأفقية. داخل INL ، توجد نوى الخلايا الأفقية وثنائية القطب والأمكرين. داخل IPL ، تتشابك المحطات المحورية للخلايا ثنائية القطب والأماكرين مع تشعبات RGCs. داخل GCL ، تشكل RGCs معظم أجسام الخلايا ، ولكن يمكن أيضا العثور على بعض خلايا amacrine المخلوعة هناك. تشكل محاور RGCs RNFL ، وعلاوة على ذلك - العصب البصري7،8،9.

تؤدي العديد من أمراض العيون ، مثل الاضطرابات التنكسية العصبية في شبكية العين ، إلى عمى لا رجعة فيه وغير قابل للشفاء10. تعتبر الرؤية من أهم الحواس11 ، والعمى الدائم يقلل بشكل كبير من جودة حياة المريض. لتعزيز فهم الآليات المرضية للعديد من الأمراض ، يتم إجراء البحوث قبل السريرية باستخدام مزارع الخلايا أو النماذج الحيوانية على نطاق واسع. توفر الدراسات قبل السريرية التي تستخدم التجارب فرصة لتقييم الآليات المرضية الكامنة وراء أمراض العيون وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة. يمكن نمذجة أمراض العيون في كل من الكبيرة (والأبقار والقطط) الصغيرة (الأرانب والجرذان والفئران وسمك الزرد). يتيح استخدام الكبيرة وصولا أفضل إلى العين نظرا لحجمها. من ناحية أخرى ، تسمح التجارب التي أجريت على القوارض ، نظرا لتكاثرها السريع نسبيا ، بتكاثر السلالات الفطرية التي تتميز بالقابلية للإصابة بأمراضمعينة 12،13.

في النماذج الحيوانية ، يكون الاستئصال ممكنا ، مما يتيح إجراء فحص نسيجي مرضي مفصل لمقلة العين ، مع تقييم الأمراض الطفيفة التي تظهر في هياكل معينة من العين أثناء تطور المرض - وهو فحص نادرا ما يتم إجراؤه بين البشر. يعد التقييم النسيجي المرضي أداة قيمة للغاية أثناء البحث عن الآليات المرضية لاضطرابات العين. في الأدبيات المنشورة ، فإن أوصاف منهجية الفحص النسيجي لمقل العيون محدودة للغاية ، وتفتقر إلى أدلة خطوة بخطوة ، مما يجعل من الصعب على المبتدئين إعادة إنشائها. تهدف هذه الدراسة إلى تقديم طريقة بسيطة وموجزة لإعداد الشرائح النسيجية وتقييم شبكية العين للفئران والفئران.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للإرشادات المؤسسية. تم الحصول على مقل العيون المستخدمة في هذه الدراسة من المدرجة في تجربة أجريت بناء على رقم الموافقة على الدراسة WAW2 / 122/2020 الصادر عنلجنة الأخلاقيات المحلية الثانية في جامعة وارسو لعلوم الحياة في وارسو ، بولندا. تم تطوير بروتوكولنا من خلال فحص الفئران التي تتراوح أعمارها بين 11 و 44 أسبوعا والفئران التي تتراوح أعمارها بين 6 و 12 و 16 أسبوعا.

1. تحضير مقل العيون الفأر

ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول طريقة تحضير أقسام من مقل العيون الفئران وتم تطويره باستخدام مقل العيون التي تم حصادها من: إناث C57Bl / 6 فئران تتراوح أعمارها بين 11 أسبوعا (متوسط الوزن 21 جم) ، إناث C57Bl / 6 فئران تبلغ من العمر 44 أسبوعا (متوسط الوزن 25 جم) ، إناث DBA / 2 فئران تتراوح أعمارهن بين 11 أسبوعا (متوسط الوزن 21.5 جم) ، وإناث DBA / 2 فئران تتراوح أعمارهن بين 44 أسبوعا مصابة بالزرق (متوسط الوزن 25 جم).

  1. الاستئصال
    1. استخدم ملقطا صغيرا لفتح الجفون. اضغط على الجفون حتى تدلي مقلة العين.
    2. قم بتشريح مقلة العين من التجويف عن طريق قطع الأنسجة خلف مقلة العين بمقص صغير حاد. بمجرد إزالة مقلة العين من المدار ، قم بقطع النسيج الضام البارز والعضلات المحيطة بالعين.
      1. ضع علامة على مقل العيون للحصول على اتجاه أفضل ، على سبيل المثال ، عن طريق ربط خياطة صغيرة على جذع وتر العضلة المستقيمة الجانبية لمقلة العين لتحديد الجانب الصدغي لمقلة العين.
  2. تثبيت الأنسجة
    1. ضع مقلة العين المنزوعة الحلق في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل واتركها ترتاح في محلول 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) المذاب في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) لمدة 24 ساعة.
    2. بعد ذلك ، عالج مقلة العين لمدة 24 ساعة في محلول 10٪ من السكروز ، ثم قم بإزالتها ووضعها لمدة 24 ساعة في محلول 20٪ من السكروز ، وأخيرا ، قم بإزالتها ووضعها لمدة 24 ساعة في محلول 30٪ من السكروز.
      ملاحظة: طوال العملية ، حافظ على مقلة العين عند درجة حرارة منخفضة تبلغ 4 درجات مئوية. يجب تجنب ثقوب الإبرة لتسلل السكروز لتقليل مخاطر تلف مقلة العين.
  3. تجميد الأنسجة وتخزينها
    1. قم بإزالة مقلة العين من محلول السكروز وجففها عن طريق غمسها برفق بمنشفة ورقية.
    2. ضع مقلة العين في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل وقم بتجميدها عند - 80 درجة مئوية للمعالجة المستقبلية.
      ملاحظة: إذا تم تخزينها في درجة حرارة - 80 درجة مئوية ، يمكن أن تظل مقلة العين قابلة للحياة لمدة تصل إلى 12 شهرا حتى المعالجة المستقبلية.
  4. إعداد الشريحة
    1. قم بإذابة مقلة العين في درجة حرارة الغرفة. انقله من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى كاسيت واشطفه تحت الماء الجاري لمدة 20 دقيقة لغسل السكروز.
    2. قم بتجفيف مقلة العين عن طريق وضعها فيها ، ثم إزالتها من المحاليل التالية تحت غطاء الدخان: محلول 70٪ من الكحول الإيثيلي (EtOH) لمدة 10 دقائق ، محلول 80٪ من EtOH لمدة 10 دقائق ، محلول 96٪ من EtOH لمدة 10 دقائق ، محلول 99.9٪ من EtOH لمدة 10 دقائق ، والأسيتون لمدة 5 دقائق.
    3. نظف مقلة العين عن طريق وضعها في الزيلين لمدة 5 دقائق تحت غطاء الدخان.
    4. قم بإذابة البارافين عن طريق وضع بعض البارافين الصلب في دورق ووضعه في حاضنة مختبرية مضبوطة على درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الانصهار المحددة من قبل الشركة المصنعة للبارافين (تتراوح درجة حرارة انصهار البارافين بين 46 درجة مئوية و 68 درجة مئوية). بعد ذوبان البارافين تماما (يعتمد الوقت على كمية البارافين المستخدمة) ، حرك مقلة العين إلى الدورق باستخدام البارافين واحتفظ بالدفء في الحاضنة لمدة 1 ساعة. خلال 1 ساعة من تسلل البارافين إلى الأنسجة ، حرك البارافين كل 10 - 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام معالج المناديل الذي يتيح تسلل البارافين أثناء تقليب المحلول في هذه الخطوة.
    5. قم بتضمين مقلة العين في كتلة البارافين كما هو موضح أدناه.
      1. افتح الكاسيت وقم بإزالة الغطاء العلوي. اختر قالبا معدنيا واسكب كمية صغيرة من البارافين لتغطية قاع القالب. قم بإزالة مقلة العين من الكاسيت بالملقط وضعها على البارافين في القالب. ضع مقلة العين على جانبها لضمان القطع في المستوى السهمي.
        ملاحظة: وضع مقلة العين على جانبها (مع وجود العمود الأمامي على جانب واحد والقطب الخلفي إلى الجانب الآخر) سيمكن من القطع في المستوى السهمي. بهذه الطريقة ، سيتم الحصول على أقسام من خلال القرنية والقزحية والجسم الهدبي والتلميذ والمحيطية والشبكية المركزية.
      2. قم بتبريد القالب لفترة وجيزة على لوح تبريد مضبوطة على - 15 درجة مئوية حتى يتجمد البارافين قليلا لتثبيت الأنسجة في مكانها. قم بتغطية الأنسجة بعناية بالبارافين وقاع الكاسيت لتشكيل كتلة. ضع الكتلة على لوحة تبريد لتتصلب بالكامل. بعد ذلك ، قم بإزالة الكتلة من القالب المعدني وضع كتل البارافين مرة أخرى على لوحة التبريد لمدة 15 دقيقة على الأقل لتبرد قبل القطع.
    6. قم بتأمين كتلة البارافين في الميكروتوم. اضبط الميكروتوم لتقليم البارافين الزائد من الكتلة (قمنا بضبطه على قطع 15 ميكرومتر) وقصه حتى منتصف مقلة العين. قم بتغيير إعدادات microtome لقطع الأقسام الرقيقة (قمنا بتعيينها لقطع 3.5 ميكرومتر) ووضع القسم على شريحة. إذا كنت تستخدم ميكروتوم مع حمام مائي مجاور ، فقم بإزالة الماء الزائد من الشريحة بمنديل رطب.
      ملاحظة: الهدف هو الحصول على 3 مقاطع عرضية على الأقل من خلال التلميذ. كلما كان الباحث أقل خبرة ، يجب الحصول على المزيد من الأقسام لضمان التقسيم على مستوى التلميذ. ضع قسمين على شريحة واحدة. أيضا ، بالنسبة للباحثين الأقل خبرة ، قم بقص الأنسجة بشكل أكثر سمكا ، على سبيل المثال ، إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر أو 5 ميكرومتر. إن استخدام ميكروتوم مع حمام مائي مجاور يجعل عملية نقل أقسام الأنسجة إلى الشرائح أسهل بكثير عند مقارنتها باستخدام الميكروتومات بدون حمامات مائية. نقطة أخرى جديرة بالملاحظة هي أنه قد يكون من الصعب قطع العدسة. لتقليل مخاطر تلف الأنسجة بسبب العدسة الهشة ، استخدم فقط شفرات ميكروتوم حادة مخصصة لقطع الأنسجة الصلبة. ضع في اعتبارك استخدام شفرة واحدة للتشذيب وأخرى لقطع الأقسام لتقليل ضعف الشفرة.
    7. ضع الشريحة في حاضنة المختبر مضبوطة على 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    8. قم بإزالة الشريحة من الحاضنة وابدأ في تلطيخها بالهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) يدويا عن طريق وضع الشريحة وإزالتها بالتتابع من وإلى المحاليل التالية. ابدأ ب 7 دقائق من الزيلين ، و 5 دقائق من الزيلين (دورق آخر بمحلول نظيف) ، و 5 دقائق من الزيلين (دورق آخر بمحلول نظيف). اتبع ذلك بدقيقتين 96٪ EtOH ، 1 دقيقة 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 1 دقيقة 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف).
    9. اغسل في 5 دقائق من الماء الجاري ، ثم دقيقتين من الهيماتوكسيلين من ماير ، و 2 دقيقة من الهيماتوكسيلين من ماير (دورق آخر بمحلول نظيف) ، و 5 دقائق من الماء الجاري ، و 5 دقائق من الماء الجاري (كوب آخر نظيف).
    10. أضف 1٪ Eosin لمدة دقيقتين ، متبوعا ب 1 دقيقة 96٪ EtOH ، 30 ثانية 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 30 ثانية 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 2 دقيقة زيلين ، 1 دقيقة زيلين (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 2 دقيقة زيلين (دورق آخر بمحلول نظيف).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، استخدم صبغة منزلقة آلية.
    11. أغلق الشريحة باستخدام مانع تسرب الشرائح الآلي. الشريحة المعدة جاهزة للتخزين والتقييم تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإجراء ختم الشرائح يدويا عن طريق وضع طبقة رقيقة من حامل البوليسترين على الأنسجة الملطخة وتغطيتها بغطاء زجاجي.
      تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التي تشمل PFA و EtOH والأسيتون والزيلين تحت غطاء دخان المختبر.

2. إعداد قسم مقل عيون الفئران وتركيب الشريحة

ملاحظة: يعرض هذا البروتوكول طريقة تحضير أقسام مقل عيون الفئران وتم تطويره باستخدام مقل العيون التي تم حصادها من: ذكور الفئران SHR التي تتراوح أعمارها بين 6 أسابيع (متوسط الوزن 115.5 جم) ، ذكور الفئران SHR التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا مع ارتفاع ضغط الدم الشرياني (متوسط الوزن 262.5 جم) ، ذكور الفئران WKY التي تتراوح أعمارها بين 6 أسابيع (متوسط الوزن 143.5 جم) ، ذكور الفئران WKY التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا (متوسط الوزن 265 جم) ، ذكور فئران لويس التي تتراوح أعمارها بين 12 أسبوعا (متوسط الوزن 310 جم) ، وذكور فئران لويس التي تتراوح أعمارهم بين 16 أسبوعا مع داء السكري المستحث (متوسط الوزن 259 جم).

  1. الاستئصال
    1. استخدم ملقطا صغيرا لفتح الجفون. اضغط على الجفون لتدلي مقلة العين.
    2. قم بتشريح مقلة العين من التجويف عن طريق قطع الأنسجة خلف مقلة العين بمقص صغير حاد.
      ملاحظة: ضع علامة على مقل العيون للحصول على اتجاه أفضل ، على سبيل المثال ، عن طريق ربط خياطة صغيرة على جذع وتر العضلة المستقيمة الجانبية لمقلة العين لتحديد الجانب الصدغي لمقلة العين.
  2. تثبيت الأنسجة
    1. ضع مقلة العين المنزوعة النومة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واتركها ترتاح في محلول 4٪ من بارافورمالدهيد (PFA) المذاب في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) لمدة 24 ساعة.
    2. بعد ذلك ، عالج مقلة العين لمدة 24 ساعة في محلول 10٪ من السكروز ، ثم قم بإزالتها ووضعها لمدة 24 ساعة في محلول 20٪ من السكروز ، وأخيرا قم بإزالتها ووضعها لمدة 24 ساعة في محلول 30٪ من السكروز.
      ملاحظة: طوال العملية ، حافظ على مقلة العين عند درجة حرارة منخفضة تبلغ 4 درجات مئوية. يجب تجنب ثقوب الإبرة لتسلل السكروز لتقليل مخاطر تلف مقلة العين.
  3. تجميد الأنسجة وتخزينها
    1. قم بإزالة مقلة العين من محلول السكروز وجففها عن طريق غمسها برفق بمنشفة ورقية.
    2. ضع مقلة العين في أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل وقم بتجميدها عند -80 درجة مئوية للمعالجة المستقبلية.
      ملاحظة: إذا تم تخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية ، يمكن أن تظل مقلة العين قابلة للحياة لمدة تصل إلى 12 شهرا حتى المعالجة المستقبلية.
  4. إعداد الشريحة
    1. قم بإزالة مقلة العين من الفريزر ومن أنبوب الطرد المركزي الدقيق. قطع مقلة العين إلى نصفين على طول المستوى السهمي بمشرط حاد. قم بإزالة العدسة وتجاهلها.
      ملاحظة: هذه الخطوة أسهل في التنفيذ على مقلة العين المجمدة ، المأخوذة حديثا من الفريزر. أثناء قص مقلة العين ، قد تتلف العدسة الأنسجة المحيطة. لتقليل مخاطر التلف ، استخدم مشرطا حادا جدا وكن حذرا.
    2. قم بإذابة مقلة العين في درجة حرارة الغرفة. انقل النصفين إلى كاسيت واشطفه تحت الماء الجاري لمدة 20 دقيقة لغسل السكروز.
    3. قم بتجفيف مقلة العين عن طريق وضعها في المحاليل التالية ثم إزالتها من المحاليل التالية تحت غطاء الدخان: محلول 70٪ من الكحول الإيثيلي (EtOH) لمدة 15 دقيقة ، محلول 80٪ من EtOH لمدة 15 دقيقة ، محلول 96٪ من EtOH لمدة 15 دقيقة ، محلول 99.9٪ من EtOH لمدة 15 دقيقة ، والأسيتون لمدة 7 دقائق.
    4. نظف مقلة العين عن طريق وضعها في الزيلين لمدة 7 دقائق تحت غطاء الدخان.
    5. قم بإذابة البارافين عن طريق وضع بعض البارافين الصلب في دورق ووضعه في حاضنة مختبرية مضبوطة على درجة حرارة أعلى من درجة حرارة الانصهار المحددة من قبل الشركة المصنعة للبارافين (تتراوح درجة حرارة انصهار البارافين بين 46 درجة مئوية و 68 درجة مئوية). بعد ذوبان البارافين تماما (يعتمد الوقت على كمية البارافين المستخدمة) ، حرك مقلة العين إلى الدورق مع البارافين واحتفظ بالدفء في الحاضنة لمدة 1 ساعة. خلال 1 ساعة من تسلل البارافين إلى الأنسجة ، حرك البارافين كل 10 - 15 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن استخدام معالج المناديل الذي يتيح تسلل البارافين أثناء تقليب المحلول في هذه الخطوة.
    6. قم بتضمين مقلة العين في كتلة البارافين كما هو موضح أدناه.
      1. افتح الكاسيت وقم بإزالة الغطاء العلوي. اختر قالبا معدنيا واسكب كمية صغيرة من البارافين لتغطية قاع القالب. قم بإزالة مقلة العين من الكاسيت بالملقط وضعها على البارافين في القالب. ضع نصف مقلة العين مع قاع الكوب لأعلى ، والآخر لأسفل.
        ملاحظة: وضع نصفي مقلة العين مع نصف مع قاع الكوب لأعلى ، والآخر لأسفل سيمكن قطع الأنسجة في المستوى السهمي. بهذه الطريقة ، سيتم الحصول على أقسام من خلال القرنية والقزحية والجسم الهدبي والتلميذ والمحيطية والشبكية المركزية.
      2. قم بتبريد القالب لفترة وجيزة على لوح تبريد مضبوطة على - 15 درجة مئوية حتى يتجمد البارافين قليلا ويثبت مقلة العين في مكانها. قم بتغطية مقلة العين بعناية بالبارافين وقاع الكاسيت لتشكيل كتلة. ضع الكتلة على لوحة تبريد لتتصلب بالكامل. بعد ذلك ، قم بإزالة الكتلة من القالب المعدني وضع كتل البارافين مرة أخرى على لوحة التبريد لمدة 15 دقيقة على الأقل لتبرد قبل القطع.
    7. قم بتأمين كتلة البارافين في الميكروتوم. اضبط الميكروتوم لتقليم البارافين الزائد من الكتلة (قمنا بضبطه على قطع 15 ميكرومتر) وقصه حتى تصل إلى مركز مقلة العين. قم بتغيير إعدادات microtome لقطع الأقسام الرقيقة (قمنا بتعيينها لقطع 3.5 ميكرومتر) ووضع القسم على شريحة. إذا كنت تستخدم ميكروتومي مع حمام مائي مجاور ، فقم بإزالة الماء الزائد من الشريحة بمنديل رطب.
      ملاحظة: الهدف هو الحصول على 3 مقاطع عرضية على الأقل من خلال التلميذ. كلما كان الباحث أقل خبرة ، يجب الحصول على المزيد من الأقسام لضمان التقسيم على مستوى التلميذ. ضع قسمين على شريحة واحدة. أيضا ، بالنسبة للباحثين الأقل خبرة ، قم بقص الأنسجة بشكل أكثر سمكا ، على سبيل المثال ، إلى أقسام بسمك 4 ميكرومتر أو 5 ميكرومتر. إن استخدام ميكروتوم مع حمام مائي مجاور يجعل عملية نقل أقسام الأنسجة إلى الشرائح أسهل بكثير عند مقارنتها باستخدام الميكروتومات بدون حمامات مائية.
    8. قم بإزالة الشريحة وابدأ في تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) يدويا عن طريق وضع الشريحة وإزالتها بالتتابع من وإلى المحاليل التالية. ابدأ ب 7 دقائق من الزيلين ، و 5 دقائق من الزيلين (دورق آخر بمحلول نظيف) ، و 5 دقائق من الزيلين (دورق آخر بمحلول نظيف). اتبع ذلك بدقيقتين 96٪ EtOH ، 1 دقيقة 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 1 دقيقة 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف).
    9. اغسل في 5 دقائق من الماء الجاري ، ثم دقيقتين من الهيماتوكسيلين من ماير ، و 2 دقيقة من الهيماتوكسيلين من ماير (دورق آخر بمحلول نظيف) ، و 5 دقائق من الماء الجاري ، و 5 دقائق من الماء الجاري (كوب آخر نظيف).
    10. أضف 1٪ Eosin لمدة دقيقتين ، متبوعا ب 1 دقيقة 96٪ EtOH ، 30 ثانية 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 30 ثانية 96٪ EtOH (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 2 دقيقة زيلين ، 1 دقيقة زيلين (دورق آخر بمحلول نظيف) ، 2 دقيقة زيلين (دورق آخر بمحلول نظيف).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، استخدم صبغة منزلقة آلية.
    11. أغلق الشريحة باستخدام مانع تسرب الشرائح الآلي. الشرائح المعدة جاهزة للتخزين والتقييم تحت المجهر الضوئي.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإجراء ختم الشرائح يدويا ، عن طريق وضع طبقة رقيقة من حامل البوليسترين على الأنسجة الملطخة وتغطيتها بغطاء زجاجي.
      تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التي تشمل PFA و EtOH والأسيتون والزيلين تحت غطاء دخان المختبر.

3. تقييم أقسام مقلة العين

  1. مسح الشرائح
    1. ضع الشريحة في ماسح ضوئي للشرائح النسيجية المرضية وامسح الأقسام باستخدام وضع المسح: 40x. احفظ الصور كملفات رقمية عالية الدقة.
  2. تحليل الشرائح
    1. افتح الملف الممسوح ضوئيا باستخدام برنامج عرض الصور. ابحث عن المقاطع العرضية للتلاميذ وقم بتحليل ثلاثة أقسام متتالية.
    2. ابحث عن الجزء السميك من شبكية العين وقم بتكبير الصورة إلى 20x بالضغط على مربع التكبير في الزاوية العلوية اليمنى واختيار 20x. حرك الماوس إلى مستوى ELM في الجزء السميك من شبكية العين واضغط على الزر الأيمن على الماوس ، واختر التعليق التوضيحي ، والمسطرة.
    3. حرك الماوس باتجاه ILM وانقر فوق الزر الأيسر. قم بتسمية القياس RT وحدد المربعين إظهار العنوان وطول العرض. بهذه الطريقة ، سيتم قياس سمك الشبكية (RT) ، وسيظهر القياس بالميكرومتر. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 2 والشكل 3.
    4. استخدم المسطرة ، وقم بقياس سمك كل طبقة من طبقات الشبكية ، بما في ذلك OLL و OPL و INL و IPL ، وقم بتسميتها بذلك. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 4 والشكل 5.
    5. لحساب عدد الخلايا داخل GCL ، حدد طولا محددا مسبقا لشبكية العين. على سبيل المثال ، بالنسبة لشبكية العين ، استخدم قسما واحدا بطول 500 ميكرومتر ، وبالنسبة لشبكية الفئران ، استخدم خمسة أقسام 100 ميكرومتر.
    6. باستخدام المسطرة ، قم بقياس المسافة المختارة على طول GCL. اضغط على الزر الأيمن على الماوس وحدد التعليق التوضيحي > المحفوظ > 1x RBC. انقر فوق كل خلية تم تحديدها على أنها جسم دائري ملطخ بالهيماتوكسيلين على طول GCL على طول شبكية العين المحدد مسبقا. احسب عدد الخلايا المحيطة. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل 6 والشكل 7.
    7. بعد تحليل ثلاثة أقسام متتالية ، ارسم المتوسط لجميع القياسات.

النتائج

باستخدام البروتوكول المقدم ، يمكن تقييم تشريح ومورفولوجيا هياكل معينة لمقلة العين بالتفصيل. يركز فريقنا على البحث في الآليات المرضية للتنكس العصبي في اضطرابات الشبكية ، مثل الجلوكوما واعتلال الشبكية السكري واعتلال الشبكية الناتج عن ارتفاع ضغط الدم. لتقييم ميزات التنك...

Discussion

يعد الفحص النسيجي لمقلة عين الفئران والجرذان أداة قوية في مجال طب العيون التجريبي. يمكن أن يوفر معلومات جديدة تتعلق بالتغيرات في هياكل العين في سياق أمراض العيون ، والتي لن يتم ملاحظتها في البيئات السريرية. تقدم البروتوكولات الموصوفة طريقة بسيطة لإجراء تحليل نسيجي لشبك...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل العمل ، بما في ذلك الفئران ، كجزء من مشروع TIME 2 MUW - التميز في التدريس كفرصة لتطوير جامعة وارسو الطبية بتمويل مشترك من الصندوق الاجتماعي الأوروبي في إطار البرنامج التشغيلي لتطوير تعليم المعرفة للفترة 2014-2020 ، رقم اتفاقية التمويل المشترك: POWR.03.05.00-00-Z040 / 18-00. تم تنفيذ العمل ، بما في ذلك الفئران ، كجزء من مشروع تم تنفيذه في الأعوام من 2020 إلى 2022 ، بتمويل من دعم العلوم الذي حصلت عليه جامعة وارسو الطبية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetone Chempur 111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm TipsWorld Precision Instruments14095small, microsurgical forceps
EosinMar-Four4P.05.2001/LAqueous solution
Ethyl alcohol 96 %Chempur CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %Chempur CH.ETYL.ALK.99,9%BWUse to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483ENuAire13027D0034Freezing temperature - 80 °C
Glass slidesMar-FourMI.15.01673Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass CoverslipperLeica Biosystems 14,04,78,80,101Automated slide sealer 
Mayer's hematoxylinChempur 124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mmLeica Biosystems 3803081
Microme HM 340 EThermo Scientific90-519-0Microtome
Microtome razor bladesMar-FourHI.N.35Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassetteMar-FourLN.13874550
Microwave Hybrid Tissue ProcessorMilestone
Multistainer Leica ST5020Leica Biosystems Automated slide stainer 
NanoZoomer 2.0-HT slide scannerHamamatsuC9600Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing softwareHamamatsuU12388-01Image viewing software
Paraffin Pathowax PlusMar-Four4P.PWP.010Melting temperature 56 °C - 58 °C
ParaformaldehydeSigma - Aldrich441244-1KGPrepare a 4% solution in PBS
PBS TabletsMerck Millipore524650-1EAUse to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLThermo Scientific69715
Refrigerator-freezer EN14000AWElectrolux925032562-00refrigeration 4 °C
Scalpel bladeSwann-MortonT.OST.SKAL00.024
SucroseChempur 427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, CurvedWorld Precision Instruments501925curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealersMar-FourKP-3020/SMRH001
XyleneChempur CH.KSYL.5l.METAL.OP 

References

  1. Kels, B. D., Grzybowski, A., Grant-Kels, J. M. Human ocular anatomy. Clin Dermatol. 33 (2), 140-146 (2015).
  2. Gupta, M. P., Herzlich, A. A., Sauer, T., Chan, C. C. Retinal anatomy and pathology. Dev Ophthalmol. 55, 7-17 (2016).
  3. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  4. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  5. Boulton, M., Dayhaw-Barker, P. The role of the retinal pigment epithelium: Topographical variation and ageing changes. Eye (Lond). 15 (Pt 3), 384-389 (2001).
  6. Baden, T., Euler, T., Berens, P. Understanding the retinal basis of vision across species. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 5-20 (2020).
  7. Nguyen-Ba-Charvet, K. T., Chédotal, A. Development of retinal layers. C R Biol. 337 (3), 153-159 (2014).
  8. Adams, T., Chernoff, E., Wilson, J., Dharmarajan, S. Reactive muller glia as potential retinal progenitors. InTech. , (2013).
  9. Salman, A., Mcclements, M. E., Maclaren, R. E. Insights on the regeneration potential of müller glia in the mammalian retina. Cells. 10 (8), 1957 (2021).
  10. Marchesi, N., Fahmideh, F., Boschi, F., Pascale, A., Barbieri, A. Ocular neurodegenerative diseases: Interconnection between retina and cortical areas. Cells. 10 (9), 2394 (2021).
  11. Enoch, J., Mcdonald, L., Jones, L., Jones, P. R., Crabb, D. P. Evaluating whether sight is the most valued sense. JAMA Ophthalmol. 137 (11), 1317-1320 (2019).
  12. Struebing, F. L., Geisert, E. E. What animal models can tell us about glaucoma. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 365-380 (2015).
  13. Bouhenni, R. A., Dunmire, J., Sewell, A., Edward, D. P. Animal models of glaucoma. J Biomed Biotechnol. 2012, 692609 (2012).
  14. Wilding, L. A., Uchihashi, M., Bergin, I. L., Nowland, M. H. Enucleation for treating rodent ocular disease. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (3), 328-332 (2015).
  15. Lin, C. H., et al. A protocol to inject ocular drug implants into mouse eyes. STAR Protoc. 3 (1), 101143 (2022).
  16. Lozano, D. C., Twa, M. D. Development of a rat schematic eye from in vivo biometry and the correction of lateral magnification in sd-oct imaging. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6446-6455 (2013).
  17. Castro, G., Navajas, E., Farah, M. E., Maia, M., Rodrigues, E. B. Migration, integration, survival, and differentiation of stem cell-derived neural progenitors in the retina in a pharmacological model of retinal degeneration. ISRN Ophthalmol. 2013, 752161 (2013).
  18. Chai, G. R., Liu, S., Yang, H. W., Chen, X. L. Quercetin protects against diabetic retinopathy in rats by inducing heme oxygenase-1 expression. Neural Regen Res. 16 (7), 1344-1350 (2021).
  19. Igarashi, T., et al. Tyrosine triple mutated aav2-bdnf gene therapy in a rat model of transient iop elevation. Mol Vis. 22, 816-826 (2016).
  20. Zhang, W., et al. Therapeutic efficacy of neural stem cells originating from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in diabetic retinopathy. Sci Rep. 7 (1), 408 (2017).
  21. Dorfman, D., Aranda, M. L., Rosenstein, R. E. Enriched environment protects the optic nerve from early diabetes-induced damage in adult rats. PLoS One. 10 (8), e0136637 (2015).
  22. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest. 102 (4), 783-791 (1998).
  23. Steinle, J. J., Kern, T. S., Thomas, S. A., Mcfadyen-Ketchum, L. S., Smith, C. P. Increased basement membrane thickness, pericyte ghosts, and loss of retinal thickness and cells in dopamine beta hydroxylase knockout mice. Exp Eye Res. 88 (6), 1014-1019 (2009).
  24. Polley, E. H., Walsh, C. A technique for flat embedding and en face sectioning of the mammalian retina for autoradiography. J Neurosci Method. 12 (1), 57-64 (1984).
  25. Turner, K. W. Hematoxylin toluidine blue-phloxinate staining of glycol methacrylate sections of retina and other tissues. Stain Technol. 55 (4), 229-233 (1980).
  26. Cheng, J., et al. Correlation of optical coherence tomography and retinal histology in normal and pro23his retinal degeneration pig. Transl Vis Sci Technol. 7 (6), 18 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved