الحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة

Summary

تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.

Abstract

يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.

Introduction

ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة ¹. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا². يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها

Protocol

1. إعداد البلازميدات

1. اعزل البلازميدات من 4 مل من المزارع البكتيرية الليلية باستخدام مجموعة البلازميد المصغرة. Elute مع 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشفط.
   ملاحظة: ليس من الضروري عزل البلازميدات باستخدام مجموعة تحضير البلازميد ميدي. يمكن لمجموعة miniprep البلازميد أن تلبي تماما المتطلبات التجريبية للحقن المجهري للجنين. في هذا البروتوكول ، تحتوي بلازميدات UAS-cDNA / ORF المحضرة على عشر نسخ من UAS ، ومحفز Hsp70 الأدنى ، وموقع attB ، وجين أبيض صغير ، وجين مهم.
2. تحديد تركيز الحمض النووي للبلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية.
   ملاحظة: تركيز البلازميد ليس حاسما لنجاح الحقن المجهري للجنين، حيث أن تركيز....

النتائج

طرف إبرة الحقن مشطوف بمطحنة إبرة (الشكل 1). يمكن للمرء شطبة 50-60 إبرة في ساعة واحدة. يتم حقن الحمض النووي (DNA) في الجزء الخلفي من الجنين في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك (الشكل 2 أ). يمكن تحديد موقع الجزء ال.......

Discussion

هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض الن.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm Cell Strainer	NEST	258367
3M double-sided adhesive	3M	415
Borosilicate glass	SUTTER	B100-75-10
Diamond abrasive plate	SUTTER	104E
FLAMING/BROWN Micropipette Puller	SUTTER	P-1000
Foot air pump with pressure gauge	Shenfeng	SF8705D
Halocarbon oil 27	Sigma	H8773
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898
Inverted microscope	Nikon	ECLIPSE Ts2R
Microinjection pump	eppendorf	FemtoJet 4i
Micromanipulator	eppendorf	TransferMan 4r
Micropipette Beveler	SUTTER	BV-10
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm)	CITOLAS	10211818C
Microscope slides (25 mm x 75 mm)	CITOLAS	188105W
Petri dish (90 mm x 15 mm)	LAIBOER	4190152
Photo-Flo 200	Kodak	1026269
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Stereo Microscope	Nikon	SMZ745