A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا محسنا للحقن المجهري للأجنة ، وهي خطوة حاسمة لإنشاء الذباب المعدل وراثيا.
يعد التحوير الوراثي في ذبابة الفاكهة نهجا أساسيا لدراسة وظيفة الجينات على مستوى الكائن الحي. الحقن المجهري للأجنة هو خطوة حاسمة لبناء الذباب المعدل وراثيا. يتطلب الحقن المجهري بعض أنواع المعدات ، بما في ذلك حاقن دقيق ، ومناور دقيق ، ومجهر مقلوب ، ومجهر ستيريو. البلازميدات المعزولة بمجموعة البلازميد المصغرة مؤهلة للحقن المجهري. تخضع الأجنة في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك ، للحقن المجهري. مصفاة الخلية تخفف من عملية إزالة الأجنة. يجب تحديد الوقت الأمثل لنزع الأجنة وتجفيفها تجريبيا. لزيادة كفاءة الحقن المجهري للأجنة ، يجب أن تكون الإبر التي أعدها مجتذب مشطوفة بواسطة مطحنة إبرة. في عملية طحن الإبر ، نستخدم مضخة هواء القدم مع مقياس ضغط لتجنب التأثير الشعري لطرف الإبرة. نقوم بشكل روتيني بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد ونحصل على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات. تأخذ هذه المقالة الجينات المحورة بوساطة phiC31 integrase في ذبابة الفاكهة كمثال وتقدم بروتوكولا مفصلا للحقن المجهري للجنين للجينات المحورة في ذبابة الفاكهة.
ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster قابلة للغاية للتلاعب الجيني والتحليل الجيني. يستخدم ذباب الفاكهة المعدل وراثيا على نطاق واسع في البحوث البيولوجية. منذ أن تم تطويره في أوائل ثمانينيات القرن العشرين ، كان التحوير بوساطة P-element transposon لا غنى عنه لأبحاث ذبابة الفاكهة 1. في بعض السيناريوهات ، تم استخدام ترانسبوزونات أخرى ، مثل piggyBac و Minos في الجينات المحورة في ذبابة الفاكهة أيضا2. يتم إدخال جينات التحوير عبر transposon بشكل عشوائي في جينوم ذبابة الفاكهة ، وقد تختلف مستويات التعبير عن الجينات المحورة في مواقع جينومية مختلفة بسبب تأثيرات الموضع وبالتالي لا يمكن مقارنتها
1. إعداد البلازميدات
طرف إبرة الحقن مشطوف بمطحنة إبرة (الشكل 1). يمكن للمرء شطبة 50-60 إبرة في ساعة واحدة. يتم حقن الحمض النووي (DNA) في الجزء الخلفي من الجنين في مرحلة ما قبل الأرومة أو مرحلة البلاستوديرم المخلوي ، حيث تشترك النوى في سيتوبلازم مشترك (الشكل 2 أ). يمكن تحديد موقع الجزء ال.......
هنا ، نقدم بروتوكولا للحقن المجهري للأجنة لالجينات المحورة في ذبابة الفاكهة. بالنسبة للجينات المحورة الخاصة بالموقع بوساطة phiC31 ، قمنا بحقن 120-140 جنينا لكل بلازميد وحصلنا على خط واحد على الأقل معدل وراثيا لحوالي 85٪ من البلازميدات (الجدول التكميلي 2). في تجربتنا ، يكفي الحمض الن.......
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم العمل من قبل صندوق البحث العلمي للمواهب رفيعة المستوى ، جامعة جنوب الصين.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved