التصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية الخلوية في عضويات الورم المشتقة من المريض

Summary

هنا ، نوضح بالتفصيل نهجا مباشرا للتصوير المباشر لتحديد حساسية عضويات الورم المشتقة من المريض للإشعاع المؤين.

Abstract

العلاج الإشعاعي (RT) هو أحد الدعائم الأساسية لإدارة السرطان السريرية الحديثة. ومع ذلك ، ليست كل أنواع السرطان حساسة بنفس القدر للإشعاع ، غالبا (ولكن ليس دائما) بسبب الاختلافات في قدرة الخلايا الخبيثة على إصلاح تلف الحمض النووي التأكسدي كما تثيره الأشعة المؤينة. تم استخدام المقايسات المستنسخة لعقود من الزمن لتقييم حساسية الخلايا السرطانية المستزرعة للإشعاع المؤين ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن الخلايا السرطانية المشععة غالبا ما تموت بطريقة متأخرة يصعب تحديدها كميا باستخدام تقنيات قياس التدفق الخلوي على المدى القصير أو تقنيات الفحص المجهري. لسوء الحظ ، لا يمكن استخدام المقايسات المستنسخة على هذا النحو لنماذج الورم الأكثر تعقيدا ، مثل عضويات الورم المشتقة من المريض (PDTOs). في الواقع ، قد لا يؤدي تشعيع PDTOs الراسخة بالضرورة إلى إلغاء نموها كوحدات متعددة الخلايا ، ما لم يتم القضاء تماما على جزءها الشبيه بالجذع. علاوة على ذلك ، فإن تشعيع معلقات الخلية المفردة المشتقة من PDTO قد لا يلخص بشكل صحيح حساسية الخلايا الخبيثة ل RT في سياق PDTOs المنشأة. هنا ، نقوم بتفصيل تكييف المقايسات الاستنساخية التقليدية التي تنطوي على تعرض PDTOs الراسخة للإشعاع المؤين ، يليه تفكك الخلية الواحدة ، وإعادة الطلاء في ظروف الثقافة المناسبة والتصوير الحي. تعمل الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المشتقة من PDTO غير المشععة (الضابطة) على إصلاح PDTOs المتنامية بكفاءة خاصة ب PDTO ، والتي تتأثر سلبا بالإشعاع بطريقة تعتمد على الجرعة. في هذه الظروف ، يمكن قياس كفاءة تشكيل PDTO ومعدل النمو كمقياس للحساسية الإشعاعية على صور الفاصل الزمني التي تم جمعها حتى تحقق PDTOs التحكم إشغال مساحة محددة مسبقا.

Introduction

يعد العلاج الإشعاعي الخارجي (RT) أحد الدعائم الأساسية لعلم الأورام الحديث ، حيث لا يعكس فقط نشاطا واضحا مضادا للسرطان مرتبطا بمجموعة محددة جيدا من الآثار الجانبية التي يمكن التحكم فيها بشكل عام¹ ، ولكن أيضا التوافر السريري على نطاق واسع بشكل استثنائي (معظم مراكز السرطان في البلدان المتقدمة مجهزة بمسرعات خطية حديثة للشعاع الخارجي RT)². تماشيا مع هذه الفكرة ، يتم استخدام RT عالميا بنجاح لكل من الأغراض العلاجية ، بشكل عام في سياق المرض في المرحلة المبكرة ^3,4 ، والتطبيقات الملطفة ، لاحتواء الأعراض (مثل الألم) من الأورام النقيلية⁵.

Protocol

يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. الثقافة العضوية

ملاحظة: تم إنشاء TNBC # 1 PDTOs في مختبرنا بناء على أنسجة الورم التي تمت إزالتها جراحيا من مريض مصاب بسرطان الثدي الثلاثي السلبي (TNBC) الذي قدم موافقة مستنيرة للمشاركة في بروتوكول البنوك الحيوية (IRB21-06023682). بعد التحقق من صحة الأنسجة وتسلسل الحمض النووي الريبي (RNAseq) ، يتم استزراع TNBC # 1 PDTOs في 66٪ قطرات matrigel (ما يسمى "القباب") في وسط استزراع DMEM / F12 المخصب (الجدول 1) ويتم تمريرها كل 2-3 أسابيع بنسبة 1: 2-1: 10²⁸

النتائج

تعرضت TNBC # 1 PDTOs لجرعة إشعاعية واحدة من 0 (عناصر تحكم غير مشععة) ، 2 Gy ، 4 Gy ، 6 Gy ، 8 Gy ، أو 10 Gy في اليوم 0. بعد ذلك مباشرة ، تم فصل PDTOs للحصول على تعليق خلية واحدة لكل حالة تجريبية. تم بعد ذلك زرع الخلايا المشتقة من PDTO في 48 صفيحة بئر داخل قباب ماتريجل بنسبة 66٪ (50 ميكرولتر لكل منها) مود?.......

Discussion

هنا ، نصف تكيفا للمقايسات التقليدية المستنسخة التي تسخر PDTOs لسرطان الثدي والتصوير الحي لتحديد الحساسية الإشعاعية ل PDTO بناء على (1) استمرار الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية المكونة ل PTDO عند تشعيع PDTO في المختبر ، و (2) معدل نمو PDTOs التي (قد) تولدها هذه الخلايا. وتشمل الخط?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049