نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

Summary

يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا مفصلا للجينات المحورة القائمة على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران النامية. ستسهل أصول الفيديو المتوفرة هنا تعلم هذه التقنية متعددة الاستخدامات.

Abstract

قلب الثدييات هو عضو معقد يتكون أثناء التطور عبر مجموعات متنوعة للغاية من الخلايا السلفية. إن أصل هؤلاء الأسلاف وتوقيتهم ومصيرهم أمر حيوي للتطور السليم لهذا العضو. الآليات الجزيئية التي تحكم تشكل القلب ضرورية لفهم التسبب في أمراض القلب الخلقية وتجديد القلب الجنيني. استخدمت الأساليب الكلاسيكية للتحقيق في هذه الآليات توليد الفئران المعدلة وراثيا لتقييم وظيفة جينات معينة أثناء نمو القلب. ومع ذلك ، فإن الجينات المحورة للفأر هي عملية معقدة تستغرق وقتا طويلا ولا يمكن إجراؤها في كثير من الأحيان لتقييم دور جينات معينة أثناء نمو القلب. ولمعالجة هذا الأمر، قمنا بتطوير بروتوكول للتثقيب الكهربائي الفعال وزراعة القلوب الجنينية للفئران، مما يمكن الجينات المحورة العابرة من التقييم السريع لتأثير اكتساب أو فقدان وظيفة الجينات المشاركة في نمو القلب. باستخدام هذه المنهجية ، نجحنا في التعبير عن Meis1 في القلب الجنيني ، مع تفضيل نقل الخلايا النخابية ، مما يدل على قدرات التقنية.

Introduction

القلب هو أول عضو يتشكل أثناء التطور الجنيني. تتضمن هذه العملية التنسيق الزماني المكاني لمجموعات مختلفة من الخلايا السلفية من مناطق متميزة من الجنين. كل هذا يحدث بينما يستمر القلب النامي في النبض والعمل ، مع التركيز على التنسيق الرائع المطلوب لتكوينه^1،2،3. نظرا للدور الحاسم للقلب ، فإن التنظيم الصارم على المستويين الخلوي والجزيئي ضروري لتكوينه بشكل صحيح ^4,5. كان تحديد الآليات التي تتحكم في نمو القلب ذا أهمية كبيرة ، لأنها ضرورية لكشف اضطرابات القلب الخلقية ، والتي تؤثر على عدد كبير من المرضى في جميع أنحاء العالم

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على CNIC وتتوافق مع التشريعات الحالية ، بما في ذلك توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC ، على النحو الذي يفرضه القانون الإسباني بموجب Real Decreto 53/2013. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام إناث الفئران من النوع البري CD-1 الذين تتراوح أعمارهم بين 15 و 21 أسبوعا. يتم سرد التفاصيل المتعلقة بالحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. إعداد البلازميد والأداة

1. أولا ، قم بإعداد مزيج التثقيب الكهربائي عن طريق إضافة الحمض النووي البلازميد المطلوب في الثلج بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر. بعد....

النتائج

لإثبات فعالية هذه التقنية في إجراء تجارب كسب الوظيفة (GOF) لمنظمات نمو القلب ذات الصلة ، تم بناء كهربائي مفرط في التعبير عن عامل النسخ Meis1. لتحقيق ذلك ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من أجنة E9.5 ، وتم إجراء النسخ العكسي للحصول على الحمض النووي التكميلي (cDNA). باستخدام cDNA كقالب ، تم استنساخ تسلسل.......

Discussion

بشكل عام ، تقدم المنهجية الموصوفة هنا إطارا قويا للتعبير عن التركيبات المعدلة وراثيا في النخاب النامي (الشكل 4 ب) ، كما يتضح من التعبير المفرط ل Meis1 (الشكل 4C). مع التركيبات المناسبة ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير إما كسب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيف.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5