الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري باستخدام ضغط هواء ثابت للحصول على ردود فعل على فتح الإبرة

Summary

يصف هذا البروتوكول تجميع نظام هوائي لتوصيل الهواء المضغوط إلى إبرة أثناء عملية ميل الإبرة. يصف البروتوكول كذلك عملية الميلا لإنشاء إبر حقن مجهرية حادة وكيفية قياس حجم الفتحة النسبية للإبرة.

Abstract

تعد إبر الحقن المجهري أداة حاسمة في توصيل كواشف تعديل الجينوم ، ومكونات كريسبر (الحمض النووي الريبي الموجه ، وبروتين Cas9 ، وقالب المانح) ، ومكونات نظام الترانسبوزون (البلازميدات و transposase mRNA) في أجنة الحشرات النامية. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة مهمة بشكل خاص أثناء توصيل هذه العوامل المعدلة لأنها تساعد في تقليل الضرر الذي يلحق بالجنين الذي يتم حقنه ، وبالتالي زيادة بقاء هذه الأجنة مقارنة بالحقن بإبر غير مشطوفة. علاوة على ذلك ، ينتج عن ميل الإبر إبر أكثر اتساقا من إبرة إلى إبرة مقارنة بالإبر المفتوحة عن طريق كسر طرف الإبرة بشكل عشوائي عن طريق تنظيف الطرف بجسم ما (جانب غطاء ، سطح الجنين المراد حقنه ، إلخ). تسمح عملية الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري بهواء ضغط ثابت يتم توصيله إلى الإبرة للشخص الذي يثني الإبرة بمعرفة متى تكون الإبرة مفتوحة (وجود فقاعات) ويعطي أيضا مؤشرا نسبيا على حجم فتحة الإبرة. يمكن تحديد حجم الفتحة النسبية في الإبرة عن طريق ضبط ضغط الهواء الذي يتم توصيله إلى الإبرة حتى يتم الوصول إلى التوازن وتتوقف الفقاعات عن التدفق من طرف الإبرة. كلما انخفض الضغط الذي يتم عنده الوصول إلى التوازن ، زاد حجم الإبرة ؛ وعلى العكس من ذلك ، كلما زاد الضغط ، قل حجم الإبرة.

Introduction

التعديل الوراثي للحشرات هو عملية تم تطويرها في الأصل في ذبابة الفاكهة بواسطة Rubin و Spradling ، وعلى مر السنين ، تم تعديل هذه العملية لإنشاء تعديلات وراثية في الأنواع الأخرى¹. تعتمد العملية على التسليم الدقيق لمكونات التعديل التي يتم حقنها في الأجنة في نافذة زمنية ومكانية محددة داخل الجنين^{النامي 2،3،4}. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة أداة حاسمة في عملية التعديل الوراثي لبعض الحشرات ، مثل البعوض^4،5،6،

Protocol

ملاحظة: يستخدم البروتوكول كما هو موضح أدناه الشعيرات الدموية الدقيقة Sutter BV-10 المشطوفة. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول للاستخدام مع أي نموذج مشطوف الشعيرات الدموية الدقيقة.

1. تجميع المنظم ومقياس الضغط وأنابيب إمداد الهواء

1. قطع جزء من أنابيب اليوريتان للتوصيل من مصدر الهواء إلى قاعدة المنظم (R ؛ القسم 1 ، الشكل 1). يعتمد طول هذا القسم على المسافة من إمداد الهواء إلى المنظم ، والذي سيكون موجودا بجوار المشطاة.
2. حرك مشبك خرطوم على أنبوب اليوريتان ، ثم ادفع موصل خرطوم في نهاية الأنبوب. تأكد من إدخال موصل الخرطوم بالكامل عن طريق وضع موصل ا....

النتائج

الإجراء الموصوف أعلاه ينتج إبر حقن مجهرية حادة باستمرار. تتميز الإبر الحادة بأنها قادرة على إدخالها في أجنة حشرات المشيمية الناعمة ، مثل أجنة البعوض ، مع مقاومة قليلة أو معدومة من غشاء الجنين. عندما يتم حقن أجنة البعوض بالمجهر للتعديل الوراثي ، يكون غشاء الجنين مرنا نسب?.......

Discussion

يعتمد التعديل الوراثي للبعوض على الحقن الدقيق الدقيق لمواد التعديل (البلازميدات أو الحمض النووي الريبي الموجه أو البروتينات) في أجنة ما قبل الأرومة^{3،4،5،6،7،8}. من .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050