الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري باستخدام ضغط هواء ثابت للحصول على ردود فعل على فتح الإبرة

Summary

يصف هذا البروتوكول تجميع نظام هوائي لتوصيل الهواء المضغوط إلى إبرة أثناء عملية ميل الإبرة. يصف البروتوكول كذلك عملية الميلا لإنشاء إبر حقن مجهرية حادة وكيفية قياس حجم الفتحة النسبية للإبرة.

Abstract

تعد إبر الحقن المجهري أداة حاسمة في توصيل كواشف تعديل الجينوم ، ومكونات كريسبر (الحمض النووي الريبي الموجه ، وبروتين Cas9 ، وقالب المانح) ، ومكونات نظام الترانسبوزون (البلازميدات و transposase mRNA) في أجنة الحشرات النامية. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة مهمة بشكل خاص أثناء توصيل هذه العوامل المعدلة لأنها تساعد في تقليل الضرر الذي يلحق بالجنين الذي يتم حقنه ، وبالتالي زيادة بقاء هذه الأجنة مقارنة بالحقن بإبر غير مشطوفة. علاوة على ذلك ، ينتج عن ميل الإبر إبر أكثر اتساقا من إبرة إلى إبرة مقارنة بالإبر المفتوحة عن طريق كسر طرف الإبرة بشكل عشوائي عن طريق تنظيف الطرف بجسم ما (جانب غطاء ، سطح الجنين المراد حقنه ، إلخ). تسمح عملية الميلا الرطب لإبر الحقن المجهري بهواء ضغط ثابت يتم توصيله إلى الإبرة للشخص الذي يثني الإبرة بمعرفة متى تكون الإبرة مفتوحة (وجود فقاعات) ويعطي أيضا مؤشرا نسبيا على حجم فتحة الإبرة. يمكن تحديد حجم الفتحة النسبية في الإبرة عن طريق ضبط ضغط الهواء الذي يتم توصيله إلى الإبرة حتى يتم الوصول إلى التوازن وتتوقف الفقاعات عن التدفق من طرف الإبرة. كلما انخفض الضغط الذي يتم عنده الوصول إلى التوازن ، زاد حجم الإبرة ؛ وعلى العكس من ذلك ، كلما زاد الضغط ، قل حجم الإبرة.

Introduction

التعديل الوراثي للحشرات هو عملية تم تطويرها في الأصل في ذبابة الفاكهة بواسطة Rubin و Spradling ، وعلى مر السنين ، تم تعديل هذه العملية لإنشاء تعديلات وراثية في الأنواع الأخرى¹. تعتمد العملية على التسليم الدقيق لمكونات التعديل التي يتم حقنها في الأجنة في نافذة زمنية ومكانية محددة داخل الجنين^{النامي 2،3،4}. تعتبر إبر الحقن المجهري الحادة أداة حاسمة في عملية التعديل الوراثي لبعض الحشرات ، مثل البعوض^{4،5،6،7،8،9} وذباب الرمل¹⁰ بينما ليست حرجة للحشرات الأخرى ، مثل ديدان القز¹¹. غالبا ما تكون الإبر الحادة عاملا رئيسيا بين النجاح والفشل عند محاولة إنشاء حشرة معدلة وراثيا ^2,4. عادة ، يتم سحب الإبر الزجاجية ذات الشعيرات الدموية الدقيقة عن طريق تسخين الزجاج إلى النقطة التي يصبح فيها الزجاج مرنا ، مما يسمح بسحب الشعيرات الدموية إلى إبرة طرف مغلق مستدق. قبل استخدام الإبرة ، يجب فتحها بطريقة تخلق طرفا حادا للحقن. تقليديا ، يتم فتح الإبر عن طريق تنظيف طرف الإبرة برفق ضد شيء (حافة الشريحة / غطاء الغطاء ، أو الجنين ، وما إلى ذلك) الذي يتسبب في انفصال كمية صغيرة من الزجاج عن الطرف ، مما يؤدي بشكل عشوائي إلى إنشاء طرف حاد ^2,3. عملية أقل عشوائية قليلا هي الميلا الجاف ، حيث يتم إنزال الإبرة بسرعة على لوحة كاشطة مسطحة بصريا ودوارة لفترة قصيرة من الزمن ، مما يتسبب في تآكل كمية صغيرة من الزجاج من طرف الإبرة ، مما يخلق طرفا حادا. الميلا الجاف أقل عشوائية قليلا من تنظيف طرف الإبرة بشيء ما. يأخذ البروتوكول الموضح أدناه عملية الميلا خطوة إلى الأمام من خلال توفير الهواء المضغوط للإبرة المشطوفة وميلها تحت طبقة سائلة بحيث تكون الفقاعات مرئية بمجرد فتح الإبرة. يفصل هذا البروتوكول طريقة لإنتاج إبر حقن مجهرية حادة بشكل موثوق. يعد الميلا تحت طبقة سائلة تحسنا على كسر الإبرة بشكل عشوائي كما هو موضح أعلاه ، والميلا الجاف لأن المستخدم يتلقى ملاحظات حول عملية الميلا ، مما يسمح للشخص الذي ينحني بمعرفة متى تكون الإبرة مفتوحة ومدى حجم فتحة الإبرة نسبيا. يمكن أن تسمح معرفة حجم الفتح النسبي لطرف الإبرة للشخص المائل بإنشاء إبر بأحجام فتح مختلفة. أحجام فتح الإبرة المختلفة لها مزايا مختلفة ؛ على سبيل المثال ، يمكن أن تستوعب أحجام فتح الإبرة الأكبر خلطات الحقن ذات اللزوجة العالية ، بينما تسبب إبر الفتح الأصغر ضررا أقل للجنين الذي يتم حقنه.

يتم توفير الهواء للإبرة باستخدام منظم ونظام أنابيب يوريتان يعتمد على نظام حقن معدل ينظم ضغط الهواء². بينما يتم تزويد الإبرة بالهواء عند ضغط ثابت ، تكون الإبرة مشطوفة تحت طبقة من السائل. تتكون عملية الميلا من عملية متكررة من خمس خطوات: 1) خفض الإبرة إلى السطح الكاشطة ، 2) السماح للإبرة بالشطبة لفترة قصيرة من الزمن ، 3) رفع الإبرة بعيدا عن اللوحة الكاشطة مع إبقائها تحت سطح الطبقة السائلة ، 4) إيقاف دوران اللوحة الكاشطة للتحقق من ظهور الفقاعات. في حالة عدم وجود فقاعات ، يتم تكرار الخطوات من 1 إلى 4 حتى تظهر الفقاعات ؛ 5) بمجرد وجود الفقاعات ، يمكن تعديل ضغط الهواء لتحديد حجم الفتح النسبي للإبرة. كلما انخفض الضغط اللازم لوقف تكوين الفقاعة ، زادت الفتحة عند طرف الإبرة.

Protocol

ملاحظة: يستخدم البروتوكول كما هو موضح أدناه الشعيرات الدموية الدقيقة Sutter BV-10 المشطوفة. ومع ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول للاستخدام مع أي نموذج مشطوف الشعيرات الدموية الدقيقة.

1. تجميع المنظم ومقياس الضغط وأنابيب إمداد الهواء

1. قطع جزء من أنابيب اليوريتان للتوصيل من مصدر الهواء إلى قاعدة المنظم (R ؛ القسم 1 ، الشكل 1). يعتمد طول هذا القسم على المسافة من إمداد الهواء إلى المنظم ، والذي سيكون موجودا بجوار المشطاة.
2. حرك مشبك خرطوم على أنبوب اليوريتان ، ثم ادفع موصل خرطوم في نهاية الأنبوب. تأكد من إدخال موصل الخرطوم بالكامل عن طريق وضع موصل الخرطوم على سطح صلب. أثناء إمساك الأنبوب بالقرب من موصل الخرطوم ، اضغط على الأنبوب بقوة في الخرطوم حتى يتم إدخال موصل الخرطوم بالكامل. معا ، يشكل مشبك الخرطوم وموصل الخرطوم اتصال HC (الشكل 1).
3. حرك مشبك الخرطوم لأعلى حتى نهاية الأنبوب حيث يتم إدخال موصل الخرطوم. قم بتدوير مشبك الخرطوم فوق الطرف الشائك المدرج بحيث يشكل اتصالا محكم الإغلاق.
4. قم بربط موصل الخرطوم في قاعدة المنظم (R) يدويا ، ثم قم بإنهاء شد الاتصال بمفتاح ربط صغير. تأكد من أن الاتصال محكم الإغلاق ولكن ليس شديد الإغلاق.
5. في المنفذ الجانبي للمنظم ، قم بربط موصل T (T) يدويا ، ثم استخدم مفتاح ربط صغير لإنهاء الشد.
6. قطع قطعة صغيرة من أنابيب يوريتان (الشكل 1 ، القسم 2) ، طولها حوالي 3-5 سم. ضع اثنين من مشابك الخرطوم على قطعة الأنبوب ، ثم أدخل موصل خرطوم في كل طرف من طرفي الأنبوب وقم بإنهاء التوصيلات (HC) كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4 لكل طرف من طرفي الأنبوب.
7. قم بربط أحد طرفي الأنبوب القصير في قاعدة مقياس الضغط ، ثم قم بإنهاء الشد بمفتاح ربط كما في الخطوة 1.5.
8. قم بربط الطرف الآخر من الأنبوب القصير بأحد المنافذ الموجودة على الموصل T (T) المتصل بالمنظم في الخطوة 1.5.
9. قطع جزء من أنابيب اليوريتان (الشكل 1 ، القسم 3) للتوصيل بين المنظم وحامل الإبرة (NH). يعتمد حجم هذا القسم على المسافة من الشطبة إلى موقع المنظم.
10. ضع مشبك خرطوم على قسم الأنبوب ، ثم أدخل موصل خرطوم كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.4.
11. على الجانب الآخر من هذا القسم من الأنبوب ، ضع موصل luer الأنثوي (LC) المزود بحامل الإبرة (NH).
12. قم بإزالة مشبك التثبيت وغسالة النايلون (الشكل 2 ، و) من المعالج. تم تصميم مشبك التثبيت والغسالة لحمل الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية فقط ، وهي ليست مصممة لتحمل الوزن الإضافي لحامل الشعيرات الدموية الدقيقة ، والقضيب الملولب ، وأنابيب إمداد الهواء.
13. قطع قطعة مستطيلة من ورقة التعبئة المطاطية 1.5 سم × 2 سم لف قضيب الملولبة في مشبك رفرف الدراجة. سيساعد ذلك في تثبيت القضيب الملولب وحامل الإبرة بشكل أكثر أمانا في مشبك مصد الدراجة. باستخدام كماشة أنف إبرة ، افتح مشبك مصدات الدراجات ، وقم بطي القطعة المستطيلة من ورقة التعبئة المطاطية فوق القضيب الملولب 3.5 سم من أحد طرفي القضيب بحيث تشكل حرف U فوق القضيب. أدخل القضيب الملولب المغطى بالألواح المطاطية في مشبك مصدات الدراجات المفتوح واستخدم الزردية لإغلاق المشبك حول القضيب والصفيحة المطاطية. قم بتثبيت مشبك الدراجة ومجموعة القضبان الملولبة على مسمار المناور ، واستبدل مشبك التثبيت بدون غسالة النايلون ، وشد مشبك التثبيت حتى يثبت مجموعة القضيب الملولبة بإحكام.
14. خيط حامل الإبرة على القضيب الملولب. تأكد من أن موصل luer ينتهي في وضع لا يربط أنبوب اليوريتان عند توصيله (الشكل 2 ، ز).
15. قم بتوصيل موصل luer الأنثوي بموصل luer الذكر (الشكل 2 ، ز) لحامل الإبرة (الشكل 2 ، د).
16. قم بتوصيل الطرف الحر من أنبوب الشكل 1 ، القسم 1 بإمداد الهواء (سيختلف هذا الاتصال بناء على مصدر الهواء المستخدم). يجب أن يكون مصدر الهواء نظيفا وجافا وخاليا من بقايا الزيت. يمكن أن يكون إمداد الهواء من مصدر هواء المنزل أو أسطوانة الغاز ، إما الهواء المضغوط أو النيتروجين.

2. إبر البورسليكات الميلا

1. اسحب إبر الحقن المجهري باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة المصنوعة من زجاج البورسليكات مع الإعدادات التالية على الجهاز: الحرارة: 305 ، Fil: 4 ، Vel: 70 ، Del: 235 ، Pul: 160 ، مع وقت حلقة 12.24.
2. قم بتجميع مجموعة الطحن وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، والتي تتكون من اللوحة الكاشطة وحلقة التثبيت بالمغناطيس¹².
   ملاحظة: قد تحتاج اللوحة الكاشطة إلى لفها بشريط رفيع من الفيلم الشفاف لمنع التسرب المبكر ل Photo-Flo (عامل الترطيب) من اللوحة الكاشطة. هذا مطلوب فقط إذا تسرب محلول عامل الترطيب قبل الأوان إلى زيت القاعدة ، مما يتسبب في توقف لوحة الطحن عن الدوران. يقلل عامل الترطيب من خطر علامات التجفيف على الإبر الزجاجية بعد الميلات. استخدام عامل ترطيب ليس أمرا بالغ الأهمية لعملية الميلا ، ويمكن استبدال الماء.
3. ضع 10 قطرات من زيت القاعدة على سطح القاعدة المسطح بصريا وضع مجموعة الطحن في الأعلى. ابدأ تجميع الطحن.
4. قم بتشغيل مصدر الضوء لإضاءة السطح. تأكد من وضع مصدر الضوء خلف المشطوفة ويضيء بزاوية 45 درجة على اللوحة الكاشطة والإبرة. زاوية الإضاءة ضرورية بحيث يمكن رؤية ظل الإبرة بسهولة. عند التكبير 90x ، قم بتدوير رأس المجهر في مكانه. أوقف دوران اللوحة الكاشطة لفترة وجيزة وركز المجهر على سطح اللوحة الكاشطة.
5. أضف 1٪ عامل ترطيب إلى الفتيل حتى يصبح الفتيل رطبا تماما. أضف عامل ترطيب بنسبة 1٪ إلى سطح اللوحة الكاشطة. تأكد من أن عامل الترطيب يغطي السطح الكاشطة ولكنه لا يتسرب إلى حلقة التثبيت السوداء.
6. ضع الفتيل المبلل مسبقا على سطح اللوحة الكاشطة أثناء دورانها. تأكد من أن الفتيل على الجانب الأيسر من اللوحة الكاشطة (وأنت تنظر لأسفل من الأعلى) ويمتد من الساعة 11 إلى الساعة 6 (مع وضع اللوحة كوجه للساعة). تأكد من أن الفتيل لا يركب على الجزء الأسود من حلقة التثبيت.
7. أدخل إبرة في حامل الإبرة (الشكل 2 ، د) وشد حلقة التثبيت لتثبيت الإبرة في مكانها. افتح المنظم (الشكل 1 ، R) وقم بزيادة الضغط إلى 24 رطل / بوصة مربعة.
8. ارفع حامل الإبرة عن طريق تدوير مقبض ضبط المسار (الشكل 2 ، أ) تأكد من رفع الإبرة عاليا بدرجة كافية بحيث تكون أعلى من سطح اللوحة الكاشطة الدوارة ، ثم قم بتدوير المناور بالكامل بحيث تتأرجح الإبرة في مكانها فوق اللوحة الكاشطة الدوارة. يجب وضع الإبرة المراد شطبها على اللوحة الكاشطة الدوارة الموجهة بحيث يتحرك دوران اللوحة بعيدا عن طرف الإبرة (الشكل 3 أ)
9. عند المشاهدة من الجانب ، استخدم مقبض الضبط الخشن (الشكل 2 ، أ) لخفض الإبرة باتجاه سطح اللوحة الكاشطة. توقف عندما تكاد الإبرة تلامس سطح السائل.
10. استخدم التكبير / التصغير لخفض تكبير المجهر ، ثم حرك المجهر بحيث تكون الإبرة في وسط مجال الرؤية. بمجرد الوصول إلى مركز الرؤية ، قم بزيادة التكبير ، وضبط موضع المعالج بحيث يظل طرف الإبرة في مركز الرؤية. بمجرد الوصول إلى أقصى تكبير ، أوقف لوحة الطحن وركز المجهر على سطح اللوحة الكاشطة ، ثم أعد تشغيل دوران اللوحة على الفور بمجرد التركيز على السطح. قد لا تكون الإبرة في العرض في هذه المرحلة.
11. باستخدام مقبض الضبط الخشن للمناور ، اخفض الإبرة باتجاه اللوحة الكاشطة. في مجال الرؤية ، ستكون صورة الإبرة وظل (ظلال) الإبرة مرئية. عندما تكون الإبرة وظل (ظلال) الإبرة على وشك اللمس ، قم بالتبديل إلى مقبض الضبط الدقيق للمعالج واستمر في خفض الإبرة حتى تظهر الإبرة وظلالها (ظلالها) وكأنها تتلامس. في هذه المرحلة ، اقرأ الفرجار (الشكل 2 ، ج) ولاحظ القراءة. سطح اللوحة الكاشطة عند أو أسفل قراءة الفرجار هذه.
    ملاحظة: من الصعب رؤية متى تلامس الإبرة سطح اللوحة الكاشطة الدوارة ، لذلك قد لا تلمس الإبرة اللوحة الكاشطة في هذه المرحلة.
12. اسمح للإبرة بالبقاء عند هذا المستوى من قراءة الفرجار لمدة 5-10 ثوان.
13. باستخدام مقبض الضبط الدقيق للمناور ، ارفع الإبرة ، وتأكد من بقائها تحت سطح عامل الترطيب. أوقف دوران اللوحة الكاشطة لبضع ثوان ولاحظ ما إذا كانت الفقاعات تهرب من طرف الإبرة. في حالة وجود فقاعات ، انتقل إلى الخطوة 2.15. في حالة عدم وجود فقاعات، انتقل إلى الخطوة 2.14.
14. حرك الإبرة مرة أخرى إلى قراءة الفرجار باستخدام مقبض الضبط الدقيق للمناور ، ثم حركها لأسفل قليلا وخذ قراءة جديدة للفرجار ، ثم كرر الخطوات 2.12-2.13.
15. ابدأ تشغيل اللوحة الكاشطة مرة أخرى لمعرفة ما إذا كان تكوين الفقاعة يمكن ملاحظته أثناء دوران اللوحة. إذا كان الدليل على تكوين الفقاعة مرئيا أثناء دوران الصفيحة ، فمن المحتمل أن تكون فتحة طرف الإبرة كبيرة جدا بالنسبة للحقن المجهري للأجنة الحساسة ، مثل حقن أجنة البعوض. إذا كان تكوين الفقاعة غير مرئي أثناء دوران اللوحة الكاشطة ، فإن فتحة الإبرة مثالية للاستخدام في الإجراءات التي تتطلب إبرة فتح حادة وصغيرة.
16. استخدم مقبض ضبط مسار المناور لرفع الإبرة فوق اللوحة الكاشطة إلى موضع مرتفع بدرجة كافية فوق اللوحة بحيث لا تصطدم الإبرة بأي شيء حيث يتم تدوير المعالج بالكامل لتحريك الإبرة بعيدا عن اللوحة الكاشطة والمجهر.
17. بمجرد أن تصبح الإبرة في وضع يمكن إزالته دون الاصطدام بأي شيء ، اخفض ضغط الهواء إلى الصفر ، وأزل الإبرة ، وضعها في صندوق تخزين الإبرة (طبق بتري مع شريط لاصق مزدوج أو طين نمذجة لتثبيت الإبر المشطوفة) حتى الاستخدام.

3. تحديد حجم الفتح النسبي للإبرة المشطوفة

ملاحظة: يتم تحديد أحجام الفتحات النسبية للإبرة المشطوفة في الخطوة 2.13. تصف الخطوات أدناه هذه العملية بشكل أكبر.

1. بمجرد ملاحظة الفقاعات في الخطوة 2.13 ، مع عدم تدوير اللوحة الكاشطة ، قم بتقليل ضغط الهواء ببطء عن طريق تدوير مقبض ضبط المنظم (الشكل 1 ، R) حتى تتوقف الفقاعات عن التدفق من طرف الإبرة. لاحظ الضغط الذي تتوقف عنده الفقاعات عن التدفق من الحافة.
2. قم بزيادة ضغط الهواء حتى تتدفق الفقاعات مرة أخرى من طرف الإبرة. كلما زاد الضغط ، كلما كان فتح الإبرة أصغر.
3. تابع تحريك الإبرة إلى موضع يمكن إزالته بأمان الخطوات 2.16-2.17.

النتائج

الإجراء الموصوف أعلاه ينتج إبر حقن مجهرية حادة باستمرار. تتميز الإبر الحادة بأنها قادرة على إدخالها في أجنة حشرات المشيمية الناعمة ، مثل أجنة البعوض ، مع مقاومة قليلة أو معدومة من غشاء الجنين. عندما يتم حقن أجنة البعوض بالمجهر للتعديل الوراثي ، يكون غشاء الجنين مرنا نسب?...

Discussion

يعتمد التعديل الوراثي للبعوض على الحقن الدقيق الدقيق لمواد التعديل (البلازميدات أو الحمض النووي الريبي الموجه أو البروتينات) في أجنة ما قبل الأرومة^{3،4،5،6،7،8}. من ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 mm O.D. microcapillaries	World Precision Instruments
Beveler pedestal oil	Sutter Instruments	008
Bicycle fender clip	VeloOrange	R-clip 4-pack	https://velo-orange.com/products/vo-r-clip-4-pack
Boom Stand Microscope	AmScope		AMScope 3.5X-90X Trinocular LED Boom Stand Stereo Microscope or equivalent
BV-10 Beveler	Sutter Instruments	BV-10
Diamond abrasive plate	Sutter Instruments	104F	Diamond abrasive plate - extra fine (0.2 µ to 1.0 µ tip sizes)
Gasket, Buna-N	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	11761-2-pkg	Used to seal connection on T  or L connectors, if not already included with these pieces
Hose Clamp	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	5000-2-pkg
Hose connector	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	CT4-pkg	Need 5 hose connectors
Microinjection Needle Holder	World Precision Instruments	MPH3-10	Needle holder for 1mm outer diameter microcapillaries
P-2000	Sutter Instruments		Any needle puller
Photo-Flo 200 Solution	B&H Photo, Video and Audio	BH #KOPF200P  MFR #1464510	wetting agent
Pressure Gauge	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	PG-100	0-100 psi gauge
Reference wick	Sutter Instruments	X050300
Reference wick holder	Sutter Instruments	M100019
Regulator	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	01-Mar	Need #10-32 ports for connections
Rubber Packing Sheet 6 inx 6 in	Danco	Model # 59849
T fitting	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	15002-2-pkg
Threaded Bar			Either a threaded rod or bar with threaded end. Threads must be 10-32.
Urethane tubing	Clippard Instrument Laboratory, Inc.	URH1-0804-BLT-050