عزل الميتوكوندريا لتحليل الميتوكوندريا فائقة التعقيد من عينات زراعة الأنسجة والخلايا الصغيرة

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية لتحليل المعقدات التنفسية الفائقة عندما تتوفر كميات صغيرة فقط من العينات.

Abstract

على مدى العقود الماضية ، غيرت الأدلة المتراكمة حول وجود مجمعات الجهاز التنفسي (SCs) فهمنا لتنظيم سلسلة نقل إلكترون الميتوكوندريا ، مما أدى إلى اقتراح "نموذج اللدونة". يفترض هذا النموذج التعايش بين نسب مختلفة من SCs والمجمعات اعتمادا على الأنسجة أو حالة التمثيل الغذائي الخلوي. ستسمح الطبيعة الديناميكية للتجميع في SCs للخلايا بتحسين استخدام الوقود المتاح وكفاءة نقل الإلكترون ، وتقليل توليد أنواع الأكسجين التفاعلية وتفضيل قدرة الخلايا على التكيف مع التغيرات البيئية.

في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن تشوهات في تجميع SC في أمراض مختلفة مثل الاضطرابات التنكسية العصبية (مرض الزهايمر ومرض باركنسون) أو متلازمة بارث أو متلازمة لي أو السرطان. لا يزال دور تعديلات تجميع SC في تطور المرض بحاجة إلى تأكيد. ومع ذلك، فإن توافر كميات كافية من العينات لتحديد حالة تجميع اللجنة العليا غالبا ما يشكل تحديا. يحدث هذا مع الخزعة أو عينات الأنسجة الصغيرة أو التي يجب تقسيمها لإجراء تحليلات متعددة ، مع مزارع الخلايا ذات النمو البطيء أو تأتي من أجهزة الموائع الدقيقة ، مع بعض الثقافات الأولية أو الخلايا النادرة ، أو عندما يجب تحليل تأثير علاجات مكلفة معينة (مع الجسيمات النانوية ، والمركبات باهظة الثمن ، وما إلى ذلك). في هذه الحالات ، يلزم وجود طريقة فعالة وسهلة التطبيق. تقدم هذه الورقة طريقة تم تكييفها للحصول على كسور الميتوكوندريا المخصبة من كميات صغيرة من الخلايا أو الأنسجة لتحليل بنية ووظيفة SCs الميتوكوندريا عن طريق الرحلان الكهربائي الأصلي متبوعا بمقايسات نشاط الهلام أو اللطخة الغربية.

Introduction

المجمعات الفائقة (SCs) هي ارتباطات فوق جزيئية بين مجمعات السلسلة التنفسية الفردية ^1,2. منذ التحديد الأولي للطوائف المنبوذة ووصف تكوينها من قبل مجموعة Schägger ^2,3 ، والتي أكدتها لاحقا مجموعات أخرى ، ثبت أنها تحتوي على مجمعات تنفسية I و III و IV (CI ، CIII ، و CIV ، على التوالي) في مقاييس متكافئة مختلفة. يمكن تعريف مجموعتين رئيسيتين من SCs ، تلك التي تحتوي على CII (وإما CIII وحدها أو CIII و CIV) وذات وزن جزيئي مرتفع جدا (MW ، بدءا من ~ 1.5 MDa ل SC الأصغر: CI + CIII₂) وتلك التي تحتوي على CIII و CIV ولكن ليس CI ، مع حجم أصغر بكثير (مثل CIII

Protocol

ملاحظة: تم تحديد تكوين جميع وسائط الاستزراع والمخازن المؤقتة في الجدول 1 والتفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الميتوكوندريا من زراعة الخلايا

ملاحظة: كان الحد الأدنى لحجم الخلايا التي تم فحصها ~ 30-50 ميكرولتر من الخلايا المعبأة (الخطوة 1.4). يمكن أن يتوافق هذا تقريبا مع ما لا يقل عن اثنين أو ثلاثة من لوحات زراعة الخلايا 100 مم أو لوحة واحدة 150 مم عند 80-90٪ من التقاء ، اعتمادا على نوع الخلية (بين 5 × 10⁶ و 10⁷ خلايا في الخلايا المشتقة من L929 أو MDA-MB-468). يعد كسر الخلايا الفعال خ....

النتائج

تختلف غلة الميتوكوندريا التي يتم الحصول عليها باتباع البروتوكولات الموصوفة أعلاه اعتمادا على عدة عوامل مثل خط الخلية أو نوع الأنسجة ، أو طبيعة العينات (أي إذا تم استخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة) ، أو كفاءة عملية التجانس. يتم جمع الغلة المتوقعة من الميتوكوندريا من خطوط الخلايا والأنسجة.......

Discussion

تهدف التعديلات المنهجية التي تم إدخالها في البروتوكولات الموصوفة هنا إلى تجنب الخسائر وزيادة الغلة مع الحفاظ على الأنشطة المعقدة للميتوكوندريا (وهو أمر بالغ الأهمية عندما يتعرض توافر كميات كافية من العينات للخطر) وإعادة إنتاج النمط المتوقع للأنسجة أو خط الخلية من SCs (انظر الش?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	PanReac	131008
Aminocaproic acid	Fluka Analytical	7260
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Bis Tris	Acrons Organics	327721000
Bradford assay	Biorad	5000002
Coomassie Blue G-250	Serva	17524
Coomassie Blue R-250	Merck	1125530025
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506
Diamino  benzidine (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
EDTA	PanReac	131669
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Fatty acids free BSA	Roche	10775835001
Glycine	PanReac	A1067
Homogenizer Teflon pestle	Deltalab	196102
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
K2HPO4	PanReac	121512
KH2PO4	PanReac	121509
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Methanol	Labkem	MTOL-P0P
MgSO4	PanReac	131404
Mini Trans-Blot Cell	BioRad	1703930
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
MTCO1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459600
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NADH	Roche	10107735001
NativePAGE 3 to 12% Mini Protein Gels	Invitrogen	BN1001BOX
NativePAGE Cathode Buffer Additive (20x)	Invitrogen	BN2002
NativePAGE Running Buffer (20x)	Invitrogen	BN2001
NDUFA9 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459100
Nitroblue tetrazolium salt (NBT)	Sigma-Aldrich	N6876
Pb(NO3)2	Sigma-Aldrich	228621
PDVF Membrane	Amersham	10600023
Phenazine methasulfate (PMS)	Sigma-Aldrich	P9625
Pierce ECL Substrate	Thermo Scientific	32106
PMSF	Merck	PMSF-RO
SDHA Monoclonal Antibody	Invitrogen	459200
Sodium succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Streptomycin/penicillin	PAN biotech	P06-07100
Sucrose	Sigma-Aldrich	S3089
Tris	PanReac	A2264
UQCRC1 Monoclonal Antibody	Invitrogen	459140
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001