بناء نموذج Xenograft لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة الذي يحاكي تطور المرض ويتنبأ بأنشطة الأدوية

Summary

تقدم هذه الدراسة نموذجا لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) يعتمد على التلقيح داخل الرئة للكرويات متعددة الخلايا لخلايا A549-iRFP الفلورية. يلخص النموذج مراحل NSCLC السريرية ويستجيب للسيسبلاتين ، وفقا للمراقبة الديناميكية في الجسم الحي للتألق طويل الطول الموجي.

Abstract

سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) هو مرض مميت للغاية مع بيئة مجهرية معقدة وغير متجانسة للورم. في الوقت الحالي ، لا تلخص النماذج الحيوانية الشائعة القائمة على التلقيح تحت الجلد لمعلقات الخلايا السرطانية البيئة المكروية للورم في NSCLC. هنا نصف نموذج xenograft لسرطان الرئة المتعامد الذي يستخدم التلقيح داخل الرئة للكرويات متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد (MCS). على وجه التحديد ، تم استزراع خلايا NSCLC البشرية الفلورية (A549-iRFP) في صفائح دقيقة منخفضة التعلق 96 جيدا مع الكولاجين لمدة 3 أسابيع لتشكيل MCS ، والتي تم تلقيحها بعد ذلك بشكل تفاعلي في الرئة اليسرى للفئران العارية athymic لإنشاء نموذج سرطان الرئة التقويمي.

بالمقارنة مع خط الخلايا الأصلي A549 ، استجاب MCS لخط الخلايا A549-iRFP بشكل مشابه للأدوية المضادة للسرطان. ترتبط إشارة الفلورسنت ذات الطول الموجي الطويل لخلايا A549-iRFP ارتباطا وثيقا بالعلامات الشائعة لنمو الخلايا السرطانية ، بما في ذلك حجم الكرة ، وصلاحية الخلية ، ومستوى البروتين الخلوي ، مما يسمح بالمراقبة الديناميكية لنمو السرطان في الجسم الحي عن طريق التصوير الفلوري. بعد التلقيح في الفئران ، تقدم A549-iRFP MCS xenograft بشكل موثوق عبر مراحل تشبه إلى حد كبير المراحل السريرية ل NSCLC ، بما في ذلك توسع الورم الرئيسي ، وظهور الأورام الثانوية المجاورة ، ونقائل الخلايا السرطانية إلى الرئة اليمنى المقابلة والأعضاء البعيدة. علاوة على ذلك ، استجاب النموذج لعقار سيسبلاتين القياسي المضاد لسرطان الرئة مع السمية المتوقعة وتطور السرطان الأبطأ. لذلك ، فإن نموذج xenograft التقويمي للفئران من NSCLC سيكون بمثابة منصة لتلخيص تطور المرض وتسهيل تطوير الأدوية المضادة للسرطان المحتملة.

Introduction

من بين جميع اضطرابات الأورام ، لا يتسبب سرطان الرئة في أعلى خسارة في الأرواح فحسب ، بل يدعي أيضا ثاني أكبر عدد من المرضى الجدد كل عام في الولايات المتحدة¹. يقف هذا الورم الخبيث المدمر كعقبة رئيسية في الرعاية الصحية الحديثة ، ويحث على فهم أعمق لبيولوجيته المعقدة وطرائق علاجية أكثر فعالية². يمثل سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) 85٪ من سرطان الرئة ويميل إلى التطور إلى أورام صلبة³. أحد أهم التحديات في سرطان الرئة هو البيئة المكروية الديناميكية وغير المتجانسة للورم ، والتي تؤثر بعمق على تطور السرطان واستجاباته للتدخلات العلاجية^4،5

Protocol

تم إجراء الدراسة على بموافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة المحيط الهادئ (بروتوكولات 19R10 و 22R10). تم استخدام ثمانية ذكور من الفئران عارية athymic الذين تتراوح أعمارهم بين 5-6 أسابيع ، ويزن 20-25 جم ، تم تربيتها مع حمية القوارض المشار إليها وإيوائها في ظروف خالية من مسببات الأمراض (SPF) ، في هذه الدراسة. تم تعقيم الأقفاص والفراش ومياه الشرب وتغييرها بانتظام. يوضح الشكل 1 مخططا لتلقيح الورم في الفئران. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إنشاء MCS ثلاثي الأبعاد لخلايا A549-iRFP

1. احتضان ....

النتائج

توصيف A549-iRFP MCS
تم استزراع A549-iRFP MCS بنجاح في صفائح كروية بمساعدة الكولاجين والطرد المركزي. عندما وصل MCS إلى قطر حوالي 500 ميكرومتر بعد أسبوع 1 ، تعرض كل من A549 و A549-iRFP MCS لمجموعة متنوعة من الأدوية والتركيبات المضادة للسرطان لمدة 3 أيام ثم تم الاحتفاظ بها في وسط نمو خال من الأدوية لمدة 4 أي.......

Discussion

يعد بناء A549-iRFP MCS إجراء مختبريا مباشرا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة ويمكن ترجمته إلى تشكيل MCS لخطوط خلايا متعددة. يظهر MCS الذي تم إنشاؤه بمساعدة الطرد المركزي والكولاجين بنية أكثر تكاملا وشبيهة بالورم الصلب في غضون 3-4 أيام. تضمن هذه الطريقة تكوين كرويات قوية تحافظ على هيكلها المتكامل لفترات ط.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01